这个是我下载的文档的内容
基金项目] 广东省科技计划项目(C12105)
[作者简介] 吴清平(1962 - ) ,男,研究员,主要从事生物安全与
食品检测研究。
【综述】
快速测试片在食品微生物检测中的应用
吴清平1 , 孙 永1, 2, 3 , 蔡芷荷4 , 郭伟鹏1
(11广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广州 510070; 21中国科学院武汉病毒研究所,武汉 430071;
31中国科学院研究生院,北京 100049; 41广东环凯微生物科技有限公司,广州 510070)
[关键词] 微生物检测; 快速测试片; 载体; Petrifilm; 食品
[中图分类号] TS201113 [文献标识码] A [文章编号] 1004 - 8685 (2006) 05 - 0635 - 03
随着人们生活水平的不断提高,食品安全问题越来越受
到人们的重视,微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。
在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微
生物的可能。一旦污染,微生物将大量繁殖而引起食品腐败
变质, 或导致食源性感染和食物中毒。特别是近年来随着环
境污染的加剧和生态平衡的不断破坏,可导致人类感染的致
病菌的种类越来越多,病原微生物对人类的威胁越来越大。
为了防止此类事件的发生, 采用适当的检验方法来对食品进
行检测,是预防食源性中毒的重要手段。利用传统的检测方
法,主要包括形态检查和生化方法,其准确性、灵敏性均较高;
但涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工
作繁重,而且要有大量人员参与[ 1, 2 ]。为此,人们相继提出了
一系列简便、快捷、敏感、准确的检测新思路。快速测试片法
是近年来不断取得进展的一种新型的检测方法。
快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,
将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面
的生长、显色来测定食品中微生物的方法[ 3 ]。1955年,德国学
者FJ1Forg发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法- 纸
片法,使原来的检测周期由72 h 缩短到15 h,材料成本降低
了3 /4,同时大大简化了操作程序[ 4 ] 。从此,这种集化学、高分
子学和微生物学于一体的检测方法开始发展起来。近年来以
滤纸和美国3M公司的Petrifilm为载体的测试片已开始被广
泛应用[ 5 ]。
采用快速测试片检测具有显著的优点[ 1, 6, 17 ] :第一,快速
测试片可测定少量检品,不需要配制试剂,不需要大量的玻璃
器皿,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价
格低廉,加之除纸片外无其他任何废液废物,大大减少或消除
对环境的污染,以及试验后的清洗工作,减少了工作量。另
外,避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷,故适用于实
验室、生产现场和野外环境工作使用。第二,快速测试片可以
在取样时同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,
防止延长接种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多。第三,
常规法一般需要时间较长,而且要特定的温度,这样导致许多
基层单位和食品企业不能实施,也不能达到及时检测的目的。
而测试片无需进行使用前的准备工作,大大缩短了时间,对照
如表1[ 17 ] :
表1 快速测试片检测细菌和真菌培养时间( h)
种类常规法检测纸片3M测试片
细菌总数48 16～18 48
大肠菌群72～96 16～18 24
大肠杆菌240 24 48
金黄色葡萄球菌96～120 / 24～26
霉菌酵母菌72～120 / 72～120
1 以滤纸为载体的测试片
111 菌落总数测试片[ 6 ]
筛选白色、无毒、中速、密度均匀、吸附力合格的滤纸,将
滤纸裁剪成合适的尺寸,通常410 ×510 cm 大小。将灭菌的
TTC加入到无菌的培养基后,将无菌滤纸浸入其中,根据需要
控制滤纸的培养基吸附量,以适宜的温度干燥,分装于已灭菌
的聚丙烯塑料口袋内,密封备用。
TTC (氯化三苯四氮唑)是一种氧化还原指示剂,接受氢后
可形成非水溶性的红色三苯甲脂。形成红色点状物出现在滤
纸之上,计数红点的多少,即为细菌总数。由于过量的TTC可
抑制细菌生长, TTC用量选择应以不抑制菌体生长,又能灵敏
显示细菌数目为宜。使用时把1 ml待测液加于纸片上,压平
后置于37℃培养箱中培养16～18 h,即可计数。检测纸片为
一次性使用,使用后焚烧处理即可。通过实验对快速测试片
法和国标方法进行对比,结果显示两种方法在统计学上无显
著性差异,但由于滤纸具有较大的间隙,菌体长在纤维之间而
使肉眼无法判断,所以一般比实际菌数要少。
112 大肠菌群测试片
北京赛帝克生物技术有限公司、广东环凯微生物科技有
限公司等生产该产品[ 7 ]。目前,大肠菌群检测纸片已在全国
各地疾病预防控制中心实验室广泛应用,食(饮)具大肠菌群
纸片检测法已被列为中华人民共和国国标。李洪等通过大量
中国卫生检验杂志2006年5月第16卷第5期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology,May 2006; Vol 16 No 5 635
实验确定了纸片法制作的优良工艺,其和九管法检测结果的
总符合率为9415% ,统计学处理P > 0105,说明两法的检测结
果无显著性差异。浸液配方为(100 ml) :乳糖215 g、蛋白胨
115 g、胆盐0115 g、TTC 40 g/L 2 ml、琼脂011 g、NaCl 013 g、
K2HPO4 014 g、溴甲酚紫2 mg、乳化剂S 10 g/L 2 ml, pH 618
～710,灭菌条件115℃、15 min,浸泡条件60℃、110 min,烘干
温度55℃。将待测液加到纸片上后, 37℃ 培养16～18 h,即
可出结果[ 3 ] 。
结果判断:纸片上出现红色斑点, 外周黄晕或纸片产生黄
色背景, 并在黄色背景上出现红色斑点或片状黄晕者为阳性;
纸片上呈均匀紫蓝色者为阴性; 纸片呈紫蓝色, 有红点周围
无黄晕或酸性样品接种后纸片变黄, 经培养无红点者为阴性。
纸片法的准确性依赖于生物酶作用特异性和培养液的选择
性。以灭菌的滤纸吸收选择培养基, 细菌通过纤维膨胀而被
固定并生长繁殖。大肠菌群在发育时伴随产生琥珀酸脱氢
酶,将TTC还原生成红色色素, 即细菌呈红色菌落; 产生黄晕
是细菌分解乳糖产酸,使指示剂变黄的结果。TTC及琼脂粉的
用量对纸片的检测效果影响较大。TTC过多时具有抑制大肠
菌群的作用, 且可将乳糖产酸出现的黄晕覆盖; TTC过少时
红色菌落不明显。琼脂粉用量也要适宜, 过多时易从滤纸上
脱落; 过少时不易吸附在滤纸上[ 9 ] 。
113 大肠菌群、大肠杆菌纸片荧光法[ 10 ]
该测试片由上海医科大学预防医学研究所研制,利用细
菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点,建立的一种酶- 底物
反应法。将待测细菌所需的营养成分、酶促底物以及抑制杂
菌的成分固相化在纸片上,通过检测大肠菌群、大肠杆菌产生
的有关酶的活性,以达到计数的目的。已有的两种测试片可
分别检测大肠菌群和大肠杆菌,均在37℃ 培养, 24 h 后在波
长365 nm荧光灯下观察结果。最低检测量可达0～4 cfu /ml。
该方法的定性、定量结果与AOAC方法无差异。
2 以Petrifilm为载体的测试片
美国3M公司发明的一种用于菌落计数的可再生的水合
物干膜,由上下两层薄膜组成,下层的聚乙烯薄膜上印有网格
并且覆盖有培养基,上层是聚丙烯薄膜。培养基中含有微生
物生长及生化试验所需的营养及试剂,并通过一种冷水可溶
性的凝胶剂附着在上下两层膜上。凝胶剂常用为果阿胶,另
外还有黄原胶、洋豆胶等。生化试剂有特异性显色物质和抗
生素。待测样品处理后不需要增菌,直接接种纸片,适宜温度
培养后计数[ 11, 12 ]。
Petrifilm纸片已经通过国际组织AOAC的认可。法国的
AVHA和AD ILVA两个协会创办了一个食品微生物检测精确
度比对项目- RAEMA,自1988年以来,共450个实验室参与,
其统计结果中已有15% 的实验室用Petrifilm测试片进行检
测,对象包括大肠菌群、金黄色葡萄球菌等,并且结果显示用
Petrifilm有更高的检出率。许多实际样本试验也显示Petrifilm
测试片法与传统方法相比在统计学上无显著性差异[ 8, 13～16 ] 。
211 菌落总数测试片[ 1 ]
揭起覆盖的胶片,将1 ml样品悬液滴于纸片中央后盖回,
用压板轻轻压下, 将样品均匀地覆盖于培养基上。静置约
1 min使培养基中的凝胶固化。测试片水平放于37℃恒温箱
内培养。细菌总数测试片培养48 ±3 h 后计数红色菌落数作
为细菌总数,亦可用作乳酸菌测定。
212 霉菌、酵母菌测试片[ 17 ]
该测试片含霉菌酵母生长的营养物质、菌落生长的指示
剂,并添加抗生素以抑制细菌生长。接种后, 21℃～25℃培养
3～5 d,计数。酵母菌菌落特征:小型菌落,边缘清晰,颜色均
一,灰白色至蓝绿色,菌落隆起。霉菌菌落特征:大型菌落,边
缘模糊,中间颜色深暗,颜色不均一,菌落扁平。
213 大肠菌群、大肠杆菌检测纸片[ 17 ]
该测试片含有改良的VRB (Violet Red Bile)培养基及葡萄
糖苷酸酶指示剂。绝大多数大肠杆菌能产生β - 葡萄糖苷酸
酶,与培养基中的指示剂反应,产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌
菌落周围,表面覆盖的胶膜,可留住发酵乳糖产生的气体,形
成蓝色和深蓝色的菌落并有气泡相连。大肠菌群菌落在测试
片上产酸, pH指示剂使培养基变为暗红色,在红色菌落周围
有气泡者为大肠菌群。所以,一次测试即可测出大肠杆菌和
大肠菌群数:带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群,带气泡的
蓝色菌落为大肠杆菌。
214 金黄色葡萄球菌测试片[ 17 ]
该测试片含有改良的Baird Parker培养基,对于金黄色葡
萄球菌的生长有很强的选择性,并能将其鉴定出来,与3 个
Baird Parker平板加一个血浆凝固酶试管的方法等效。其可形
成暗紫色菌落,如果在测试片上有其它可疑菌落出现,可以使
用金黄色葡萄球菌确认反应片。其含有显色剂及脱氧核糖核
酸,由于金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶,具有耐高温
特性,高温处理后仍能将DNA降解而与反应片上的显色剂反
应形成粉红色环。
3 讨论
近年来,快速测试片检测虽然有了一定的发展,但仍存在
许多的问题:用滤纸作载体,滤孔过大,导致滤纸双面都有菌
落生长而无法计数;滤纸保水性差,检验培养中又不能保持湿
度充分,不利于菌体生长;滤纸检验卡存在营养物质分布不均
匀的问题,加样也不能迅速扩散,导致菌体生长分布不均匀;
另外,由于显色指示剂系统单一,不能对细菌有区别地计数,
真菌会更差,所以很难全面推广。Petrifilm测试片上覆盖一层
薄膜, 当细菌产气、产粘液过多时会出现菌落的扩散和融合,
影响计数; Petrifilm测试片面积较小, 当菌量大于250 cfu 时,
准确计数较困难;待测样品中含有的某些有机物可能使显色
减缓, 使目视效果下降, 导致计数偏低;另外,培养基吸水比
较缓慢,如果在未分布均匀前用力挤压,会使稀释液体从边缘
流出,从而影响结果。因此,开发优良的载体和更高效的显色
物质十分重要。另外,测试片法虽然有了很大发展,但也只局
限于几个指标的检测上,因此,还需要继续研究其它类型的测
试片[ 1, 5 ]。
636 中国卫生检验杂志2006年5月第16卷第5期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology,May 2006; Vol 16 No 5
随着现代高分子化学的发展,许多新型的高分子聚合物
相继合成,我们可以应用一些高吸水性、保水性、一定粘度的
高分子聚合物将培养基和特异显色物质粘附在聚乙烯或丙烯
薄膜上,如聚丙烯酸盐、交联纤维素类等作为载体,以便解决
或减少应用滤纸和Petrifilm所存在的问题。另外,现在微生物
学的发展,许多微生物的特异生理生化反应已经明确,多种微
生物特异的显色物质相继被开发,如沙门氏菌、溶血性链球
菌、单核细胞增生李斯特氏菌。因此应用于食物微生物检测
的测试片会越来越有效、准确,种类也将越来越多。
总之,微生物检测工作将向着最快速、最简易、最可靠的
方向发展,而测试片法因其自身具有的轻便、快速、简易的优
势,将成为未来微生物检测中较有前景的重要手段之一。
[参考文献]
[ 1 ] 唐漪灵,郭奕芳,吴翊,等1Petrifilm纸片法和国标法检测奶制品细
菌总数和大肠菌群数的结果比较[ J ] 1中国卫生检验杂志, 2000,
10 (3) : 325 - 3271
[ 2 ] 吴清平,周艳红,蔡芷荷1卫生微生物特异性显色培养基的研究与
应用[ J ]1中国卫生检验杂志, 2005, 15 (1) : 124 - 1261
[ 3 ] 李洪,龚涛,达永淑,等1 探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素
[ J ]1职业卫生与病伤, 2002, 17 (3) : 198 - 1991
[ 4 ] 李文勇,刁伯民1国标法和纸片法对餐具大肠菌群检测比较[ J ] 1
中国国境卫生检疫杂志, 1994, 17 (6) : 360 - 3611
[ 5 ] 段又容,万昌秀,吴刚1干片法在食品微生物检测中的应用[ J ] 1
食品研究与开发, 1999, 20 (1) : 40 - 421
[ 6 ] 王善雨,郏付礼,郑晔,等1菌落总数快速检测纸片的研究与应用
[ J ]1航空军医, 1996, 24 (6) : 354 - 3551
[ 7 ] 卢崇南1纸片法检测大肠菌群预定结果的实验研究[ J ] 1热带医
学杂志, 2005, 5 (1) : 98 - 991
[ 8 ] NP Schoeller, SC Ingham1Comparison of the baird - parker agar and
3MTM petrifilmTM rap id S1aureus count p late methods for detection and
enumeration of S taphylococcus aureus[ J ]1Food Microbiology, 2001, 18
(6) : 581 - 5871
[ 9 ] 徐臻荣,阿里木•帕塔尔,王国荃1自制大肠菌群快速检测纸片使
用质量观察[ J ]1新疆医学院学报, 1997, 20 (4) : 230 - 2321
[ 10 ] 顾鸣,韩伟1简易、快速检测冷冻食品中大肠菌群、大肠杆菌的纸
片荧光法[ J ]1食品科学, 2004, 25 (1) : 135 - 1391
[ 11 ] 宋春华13M测纸片检测原料乳酸菌落总数的比较试验[ J ] 1食
品安全与检测, 2004, (5) : 60 - 611
[ 12 ] Williams, Michael G, Hesselroth, et al1Device for p ropagation and
storage ofmicroorganisms[ P ]1United States Patent, 2003166494061
[ 13 ] 黄吉诚,朱海明1霉菌和酵母菌检测纸片检测效果观察[ J ] 1食
品安全与检测, 2003, (5) : 51 - 521
[ 14 ] Jean - Christophe Augustin,Vincent Carlier1Lessons from the organi2
zation of a p roficiency testing p rogram in food microbiology by inter2
laboratory comparison: analyticalmethods in use, impact of methods
on bacterial counts and measurement uncertainty of bacterial counts
[ J ]1FoodMicrobiol, 2006, 23 (1) : 1 - 381
[ 15 ] Sasithorn Suwansonthichai, Sirirat Rengp ipat1Enumeration of coli2
forms and Escherichia coli in frozen black tiger shrimp penaeus mon2
odon by conventional and rap id methods[ J ]1 Inter J Food Microbiol,
2003, 81 (2) : 113 - 1211
[ 16 ] H Schraft, LA Watterworth1Enumeration of heterotrophs, fecal coli2
forms and Escherichia coli in water: comparison of 3MTM PetrifilmTM
p lateswith standard p lating p rocedures[ J ] 1J MicrobiolMeth, 2005,
60 (3) : 335 - 3421
[ 17 ] 王会娟,王丽,路琳,等1实验室常用的微生物快速检验技术[ J ]1
肉类工业, 2004, (9) : 40 - 421
(收稿日期: 2005 - 12 - 27)
