如何判断qPCR数据是否可靠？

王中泰

如何判断qPCR数据是否可靠？

大家好，今天小析姐跟大家聊下做的qPCR数据能不能用这个问题，判断 qPCR 数据是否可用需要考虑以下几个方面：

1.扩增曲线：扩增曲线应该呈现出典型的 S 型曲线，且曲线应该平滑，没有明显的锯齿状或平台期。



2.阈值线：阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。阈值线应该位于扩增曲线的指数增长期，且应该在曲线的中部，不应过高或过低。


3.CT 值：CT 值（循环阈值）是指扩增曲线达到阈值线所需的循环数。CT 值应该在合理的范围内，一般来说，CT 值应该在 15-35 之间。




4.内参基因：如果实验中使用了内参基因，内参基因的 CT 值应该稳定且在合理范围内。


5.重复性：qPCR 实验应该具有良好的重复性，即相同条件下重复实验得到的结果应该相似。


6.溶解曲线：单峰无杂峰，TM在75-90之间。



如果 qPCR 数据满足以上要求，则可以认为数据可用。如果数据存在异常或不符合要求，则需要进一步分析原因并采取相应的措施，如优化实验条件、重新实验等。

内标未起线（无扩增）

病毒核酸检测中，多个样本的内源性内标（如RNase P）未出现扩增曲线。而阳性对照和阴性对照均正常，表明实验体系本身无重大问题。

原因分析


样本漏加或加样错误：在加样过程中可能存在漏加样本或加错样本的情况，导致这些样本的内标无法扩增。

采样管问题：采样管保存液变质，出现沉淀或液体变浑浊，影响样本质量，从而导致内标无法扩增。

提取步骤问题：提取过程中可能存在操作不当或试剂污染，导致提取的核酸质量不佳，无法用于后续扩增。
解决方案

检查加样步骤：回顾加样过程，确认是否有漏加或加错样本的情况。


更换采样管：使用质量可靠的采样管，并检查采样管保存液的状态，避免使用变质或污染的采样管。

优化提取步骤：确保提取过程中无抑制物残留，并使用高质量的提取试剂和耗材。

内标Ct值异常偏高

在QPCR实验中，部分样本的内标Ct值异常偏高，远高于正常值范围。这些样本的阳性靶标扩增曲线正常，但内标扩增效率明显偏低。

原因分析

样本中存在抑制物：样本中可能存在某些抑制物（如多糖、蛋白质等），这些抑制物会干扰PCR扩增反应，导致内标扩增效率降低。
提取不完全：核酸提取过程中可能存在提取不完全的情况，导致提取的核酸量不足，内标扩增效率降低。

引物问题：内标引物的设计或质量可能存在问题，如引物特异性不高、纯度不够等。

解决方案


样本稀释：将样本稀释后重新进行提取和扩增，以降低抑制物的影响。


优化提取方法：优化提取步骤，确保提取完全，并使用高质量的提取试剂和耗材。

更换引物：重新设计或选择高质量的内标引物，并验证实验以确认其特异性和扩增效率。

内标扩增曲线异常（非典型S型）

在QPCR实验中，部分样本的内标扩增曲线呈现非典型S型，如曲线不平滑、有波动或翘尾。

原因分析


温度控制不稳定：qPCR仪的温度控制可能存在不稳定的情况，导致扩增过程中温度波动较大，影响扩增曲线的形态。

反应体系污染：反应体系中可能存在污染物（如DNA片段、引物二聚体），导致非特异性扩增或扩增抑制。

仪器故障：qPCR仪本身可能存在故障或老化现象，导致检测结果不准确。

解决方案


检查温度控制：检查qPCR仪的温度控制系统是否稳定可靠，必要时进行校准或维修。

优化反应体系：优化反应体系中的各组分浓度和纯度，减少污染物的干扰。同时，注意操作规范，避免交叉污染。

更换仪器：如果qPCR仪存在严重故障或老化现象且无法修复，建议更换新的仪器以确保检测结果的准确性。

内容来源：Super Lad