高效液相色谱紫外等吸收波长法快速测定秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素

王中泰

高效液相色谱紫外等吸收波长法快速测定秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素

背景介绍

秦皮为传统中药材,在《神农本草经》中就有记载,其具有清热燥湿、收涩止痢、止带和明目的功效。现代药学研究表明秦皮含有多类化学成分,包括香豆素、环烯醚萜、酚酸和黄酮等。香豆素类成分是秦皮的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌和抗病毒的药理活性。

其中秦皮甲素和秦皮乙素为秦皮药材中的主要香豆素成分,其具有抗氧化、抗肿瘤和抗糖尿病等作用,被广泛应用于秦皮药材的质量评价。前期报道采用

高效液相色谱、毛细管电泳、胶束电动色谱和荧光光谱等技术建立了秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素含量的测定方法。

其中高效液相色谱法是《中国药典》规定的秦皮药材含量测定的方法,同时也是秦皮产业中应用最多的方法。文献报道的秦皮高效液相色谱含量测定方法存在分析时间长、对照品消耗多的问题。叶皓等采用超声法制备样品,提取时间8.5 min,液相色谱分析时间63 min;赵重博等采用回流法制备样品,提取时间60 min,液相色谱分析时间60 min。以上方法的总分析时间均在60 min以上,同时也都需要2个对照品进行定量。

高效液相色谱-紫外检测分析定量原理为通过色谱柱对化合物进行分离,紫外检测器依据分析物特定波长的响应进行含量测定。前期方法为了确保分析方法的灵敏度,通常采用秦皮甲素和秦皮乙素的最大吸收波长作为检测波长。

秦皮甲素和秦皮乙素在最大吸收波长下紫外响应不一样,因此需要采用校正因子才能实现单一对照品对多个化合物的定量。如果采用秦皮甲素和秦皮乙素具有相同紫外吸收的波长作为检测波长,就有可能实现对秦皮甲素和秦皮乙素进行含量测定时采用单一对照品,并且不需要使用校正因子进行换算。核壳色谱柱具有柱效高、柱压低和分析速度快的优点,是一种适用于中药产业化快速分析检测的液相色谱柱。

区别于普通硅胶色谱柱的全多孔填料,核壳型色谱填料是由无孔硅胶核及外层包裹的多孔核壳层组成的一种表面多孔微球,其多孔的核壳层使溶剂扩散路径更短、理论塔板高度更小,因而具有更高的柱效。同时核壳填料具有更好的通透性,背压低,可使用更高的分析流速。

它可以在常规液相色谱上实现类似超高效液相色谱的快速分析,在不增加产业设备投入的情况下,可以提高产业化检测效率和降低检测成本,目前已被应

用于冬虫夏草、蛹虫草、人参和延胡索等多种中药材的液相色谱分析。

本研究采用核壳色谱柱和紫外等吸收波长的技术建立了单一对照品直接定量秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的快速HPLC分析方法,该研究为秦皮质量评价的技术提升提供了依据。

对照品溶液配制

精密称取秦皮甲素和秦皮乙素各20.18 mg,分别加无水乙醇溶解定容至10 mL,混匀,得到浓度分别为5917 μmol/L和11320 μmol/L的对照品储备液。再精密移取秦皮甲素、秦皮乙素对照品储备液,加25%(v/v)乙醇水溶液稀释得到浓度分别为147.9 μmol/L和148.2 μmol/L的混合对照品工作液。

供试品溶液制备

秦皮饮片粉碎,过三号筛,精密称取约50 mg,置于50 mL离心管中,加入25%(v/v)乙醇水溶液10 mL, 50 ℃超声(功率380 W,频率37 kHz)提取5 min,摇匀,吸取上清液,过0.22 μm有机滤膜,待测。

色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×4.6 mm,2.7 μm),柱温25 ℃,流动相为乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(6∶94, v/v),等度洗脱,流速1.5 mL/min,进样量1 μL,检测波长341 nm,带宽4 nm。

样品分析

按上一节色谱条件对空白溶液、混合对照品溶液和样品溶液进行分析,色谱图见原文图4。10批秦皮样品每批平行测定2份,分别采用外标法和等吸收波长法计算含量。

外标法使用秦皮甲素、秦皮乙素作为对照品,分别计算样品中秦皮甲素、秦皮乙素的含量。等吸收波长法使用秦皮甲素作为对照品,计算样品中秦皮乙素的含量,结果见原文表2。

通过计算两种方法的相对误差(RE), RE=(ωEAW-ωESM)/ωESM×100%(式中ωEAW为等吸收波长法测得的含量,ωESM为外标法测得的含量),发现10批秦皮样品两种方法测得的秦皮乙素含量结果相对误差在1%以内,表明两种方法无明显差异,等吸收波长法可以用于秦皮中2个分析物的含量测定。HPLC-UV等吸收波长法测得10批秦皮中的秦皮甲素、秦皮乙素含量分别为0.26%~2.80%、0.11%~1.47%,总量为0.37%~2.91%,其中9批样品符合《中国药典》要求(秦皮甲素及秦皮乙素的总量不得少于0.8%)。

文章信息

色谱, 2023, 41(8): 690-697

DOI:10.3724/SP.J.1123.2023.03018

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