基于智能手机图像的移动反应界面电泳距离检测和分析

王中泰

基于智能手机图像的移动反应界面电泳距离检测和分析

摘要

现有的电泳滴定(ET)技术仍采用计算机进行数据处理和分析,其定量检测的即时性和便携性仍存在明显不足。针对这一问题,本文发展了一种基于智能手机的ET系统,实现了ET的即时性定量分析。

该系统集成了三通道电泳滴定芯片与蓝牙通信功能,并设计了手机软件。通过该软件,不仅可以控制ET装置的电泳运行,还可以调用手机摄像头获取有色电泳界面,即时识别反应界面并显示定量检测结果。

ET装置尺寸为10 cm×15 cm×2.5 cm,重300 g,可轻松手持,适用于现场检测。本文以人源血清总蛋白和尿酸(UA)为研究目标,分别使用基于聚丙烯酰胺凝胶的蛋白电泳酸碱滴定与基于琼脂糖凝胶的尿酸酶催化电泳滴定进行检测分析。

用人血清白蛋白(HSA)标准品与尿酸标准品验证装置的性能,结果表明:HSA和UA的拟合优度(决定系数)分别为0.9959和0.9935,线性(或对数线性)范围分别为0.5~35.0 g/L和100~4000 μmol/L,检出限分别为0.05 g/L和50 μmol/L,相对标准偏差最大值分别为2.87%和3.21%,表明该系统具有较好的检测准确性和稳定性。选取了5位志愿者的血清样本,针对人源实际血样中的血清总蛋白含量和尿酸含量进行检测,并与医院临床检测所使用方法的检测结果进行对比,检测相对误差分别≤6.03%和6.21%,证明本文提出的检测系统是一种具有综合性检测潜力的通用平台,具有临床应用价值与现场检测潜力。

溶液制备与实验操作

血液样本前处理

使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集静脉血5 mL,将血液在离心机中以4000 r/min的速度离心5 min后,提取上层清液,然后将上清液加入超滤浓缩离心管以5000 r/min的速度离心20 min,样本体积浓缩到原体积1/3左右,吸取并弃去滤液,向超滤管中加入与滤液等体积的超纯水,保存在-20 ℃冰箱中备用。

总蛋白检测 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)母液:19.4 g的丙烯酰胺和0.6 g双丙烯酰胺溶于水,定容至100 mL;阳极液:100 mmol/L KCl;阴极液:100 mmol/L NaOH; HSA母液:100 g/L的HSA溶液,储存在4 ℃的冰箱备用。固定液制备AG母液与不同浓度的HSA溶液(将HSA母液稀释成30、45、60、75、90 g/L的HSA溶液)混合,加入KCl和酚酞,使得溶液内KCl浓度为0.1 mmol/L,酚酞质量分数为0.1%,依次加入APS和TEMED促凝。将固定液填充到ET芯片的3条通道中形成凝胶。凝胶固化后分别加入阳极液和阴极液,根据预先设置的电泳时间进行电泳,过程中随时通过软件调用手机摄像头获取有色电泳界面并经程序计算得出检测值。

尿酸检测 琼脂糖凝胶母液:将0.1 g的琼脂糖、0.5 mL的2 mol/L的KCl和0.1 mL的0.1 mol/L的乙酸钠混合,加水定容至10 mL;阳极液:含有不同浓度(100、150、250、400和1000 μmol/L) UA、 0.5 mg/mL尿酸酶、1 mmol/L LMG和10 μg/mL HRP的水溶液;阴极液:含有100 mmol/L KCl和100 μmol/L乙酸钠的水溶液。将琼脂糖加热溶解后注入ET芯片3条通道中形成凝胶,凝胶固化后分别加入阳极液和阴极液,根据预先设置的电泳时间进行电泳,过程中随时通过软件调用手机摄像头获取有色电泳界面并经程序计算得出检测值。

基于智能手机的ET检测系统

1a为便携式ET装置模型示意图,装置尺寸为10 cm×15 cm×2.5 cm,重300 g,可轻松手持,适用于现场检测。智能手机及开发的软件界面如图1b所示,基于智能手机ET装置的结构图如图1c所示。用户通过手机软件发送控制信息,装置中的蓝牙模块接收后控制电源模块中的升压模块为ET芯片提供24 V电压,以控制电泳的运行,或通过液晶触摸显示屏控制电泳过程。装置上提供电泳拍摄窗口,在电泳运行过程中,通过手机软件调用手机摄像头,拍摄窗口内电泳结果,并通过内置算法给出电泳检测物质及定量检测结果。手机软件是基于安卓系统开发的一款应用程序,主要包括蓝牙连接模块、数据分析模块和数据展示模块。蓝牙连接模块负责与装置通信,控制装置电泳的进行。数据分析模块负责处理电泳结果。最后电泳结果处理图及定量检测结果通过数据展示模块展示在手机屏幕上。

图 1   ET检测系统示意图

浓度-距离传感和定量计算方法

基于酸碱滴定的蛋白ET原理根据MRB蛋白电泳滴定原理,在电场的作用下,蛋白ET的运行时间t与MRB迁移距离D呈线性关系,运行时间越长,界面迁移距离越长。在运行时间相同时,界面迁移距离与蛋白质质量浓度CHSA呈线性关系,蛋白质浓度越高,界面迁移距离越短。在三通道芯片中的两个通道内固定已知浓度的蛋白标准品,在剩下的一个通道内固定未知浓度的待测蛋白样本,在相同电压下运行相同时间,测量出3条通道中的界面迁移距离。

为了减小现场复杂环境因素对标准曲线建立的影响,提高检测系统的即时性,本文通过两个蛋白标准品的浓度和界面迁移距离建立标准曲线,再将待测蛋白样本的界面迁移距离带入标准曲线,得出待测蛋白样本的浓度。

基于酶促反应的尿酸ET原理根据MRB酶促尿酸电泳滴定原理,在电场的作用下,尿酸ET的运行时间t与MRB迁移距离D呈线性关系,运行时间越长,界面迁移距离越长。与蛋白ET不同的是,在运行时间相同时,界面迁移距离与尿酸浓度c值的对数呈线性关系,且尿酸浓度越高,界面迁移距离越长。因此,不同于蛋白电泳,检测尿酸是通过两个尿酸标准品浓度的对数和界面迁移距离建立标准曲线,再将待测尿酸样本的界面迁移距离带入标准曲线,得出待测尿酸样本浓度的对数,换算后得出待测尿酸样本的浓度。

手机识别与定量方法 使用手机摄像头在自然光下采集ET图像,拍摄时保证3条通道的反应界面都处在电泳拍摄窗口内,并尽量将图片边框对准装置上的电泳拍摄窗口,使得有色通道在图片中基本处于水平位置。ET运行时间较短时,三通道的界面差异较小,建立标准曲线进行检测会造成较大的误差,在反应界面运行到电泳拍摄窗口中可以保证界面迁移时间大于1~2 min,界面迁移距离大于2 mm,此时建立标准曲线检测误差较小。采集到ET图像后,在手机上对图像进行了一系列处理,具体操作流程见图2。