梯度洗脱该注意些什么？

王中泰

梯度洗脱该注意些什么？

在反相色谱和离子交换色谱中，如果成功分离的条件不明，通常会进行梯度分离。这种梯度分离是从 10% 到 100% 的 B 溶剂（强溶剂），以线性曲线进行。(如前所述，在反相色谱中通常不推荐使用 100% 的流动相 A，因为键合烷基链会塌陷）。决定以等度模式还是梯度模式进行分离的步骤如下：

1、如果色谱峰占梯度分离时间的 25%以上，则梯度分离效果更好，甚至是唯一的可能；但是，%B 跨度可以小于 10%到 100%。假设的色谱峰模式如图 1 上半部分所示。

2、如果色谱峰所占梯度时间少于 25%（图 1 下半部分），则应尝试等度分离。可从色谱图中估算出 B 组分的有利比例。



图 1. 梯度曲线的起始延迟来自系统的死体积。色谱图来自计算机模拟

3、如果同时存在上述两种情况，通常需要寻找最佳选择性（固定相类型、B 溶剂、流动相添加剂、温度）来优化分离。梯度本身也必须经过优化，使流动相的强度在开始时足以洗脱保留最弱的分析物。之后，通过增加强溶剂的用量来改变流动相的组成，以洗脱保留较强的分析物。图 2 显示了 17 种氨基酸的分离过程。（注意，此时现在采用了适当的梯度程序。）



图 2. 用梯度洗脱分离 17 种氨基酸混合物。
流动相 A ：2 mol/L 柠檬酸钠;
流动相 B：1 mol/L磷酸钠, pH = 7.4
流动相 C：0.2 mol/L 氢氧化钠

%B 的变化可以是线性的、组成线性的、凹形的或凸形的，如图3所示。



图 3. 常见的梯度轮廓形状。

如果第二种分析物所需的洗脱强度远大于第一种分析物，凹梯度就很有用。在这种情况下，只需添加少量的 B，流动相的洗脱强度就会发生很大的变化。

某些情况下，梯度运行时会出现鬼峰。原因在于梯度洗脱的所有溶剂都必须非常纯净，否则流动相 A（或 B）中的微量杂质可能会吸附在色谱柱顶部，随后被流动相 B 洗脱，导致出现鬼峰。图 4 举例说明了这一点。在不进样的情况下，在 10 分钟内运行了 20 ~ 100%B 的梯度（随后 100%B 等度）。

条件如下：流动相 A：纯水；流动相 B，乙腈（默克公司，pro analysi）；流速，1 mL/min；固定相，Spherisorb ODS，5 mm；色谱柱，250 mm × 3.2 mm (ID)；检测器，UV 254nm。结论：使用的乙腈或水纯度不够！





图 4. 溶剂不纯导致梯度洗脱中出现鬼峰。

必须根据经验确定合适的梯度（涉及的溶剂、梯度之间的间隔时间、梯度轮廓的形状），可以遵循某些规则或借助计算机辅助。
梯度分离的缺点是：必须在梯度运行后对色谱柱进行再平衡。不过，对于采用化学键合相的色谱柱来说，这一点相对简单，只需泵送五倍于柱体积的起始流动相即可再次进样。另外，使用梯度分离时请注意仪器的死体积。

此外，如前所述，梯度洗脱通常不推荐用于吸附柱，也不适合示差折光检测器和电导检测器。