样品制备：
　　以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
　　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

　　附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法？

LST和EC初步筛选：
　　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。

　　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。

　　附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？

EMB平板：

　　取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。

　　检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

　　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。

　　附：怎样进行平板划线分离？

　　　　平板划线示例

　　　　EMB平板原理及照片

生化试验：
　　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。　　
　　1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。

　　附：靛基质试验原理及照片

　　2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

　　附：MR-VP试验原理及照片

　　3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。

　　附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片

　　4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
　　5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。

大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

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　　靛 基 质┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃典型大肠杆菌
　　　　－　┃ 　　＋　 　┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大肠杆菌
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　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中间型
　　　　－　┃　　 ＋ 　　┃ 　　－ 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中间型
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　　　　－　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型产气肠杆菌
　　　　＋　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ 　＋ 　　　┃非典型产气肠杆菌
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　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。

结果报告：

　　大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。