求助多糖的检测方法(标准)

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多糖的测定方法，目前有碱性酒石酸铜滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般说来，比色法的优点是灵敏度高，达到µg/ml（滴定法一般为mg/ml），样品用量少；但缺点是一般做常规检测时使用葡萄糖作标准品，误差较大，应以被测物的纯品作对照品，以求出换算因子，但要制备被测物的纯品并非每个实验室所能做到的，而且保健食品中往往是多种中草药的提取物作为原料而制成，所含多糖是不同相对分子量多糖的混合体，这就给提取纯品增加了难度。所以当成品中多糖含量大于1%（质量浓度）时，最好选用碱性酒石酸铜滴定。
  滴定法
    1.样品预处理
取本品适量，精密称定，置于250ml磨口烧瓶中，精密加水50ml，称定重量，置沸水浴回流2小时，放置至室温，用水补足减失重量，混匀，滤过，精密吸取续滤液15ml于100ml离心管中，加无水乙醇75ml，混匀，以4000r/min离心10min，并小心弃去上清液,再加15ml热水(温度＞90℃)冲洗离心管中沉淀物,重复一次后再以4000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用乙醇液（水：乙醇=15：75）洗涤两次，离心，弃去洗涤液。
2.样品水解
将离心管中醇析物用50ml热水（温度＞90℃)少量多次转移至250ml磨口三角瓶中，加入15ml浓盐酸，开启冷凝管，在沸水浴中回流2h，冷却，先用40％的氢氧化钠（约15ml）粗调Ph值，后用稀的氢氧化钠溶液细调，再置于PH计上调整pH在6.8～7.2之间。将中和的酸解液移置至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀,过滤，滤液供滴定用。
3.碱性酒石酸钾钠铜溶液标定
3.1精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，加10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，用滴定管加入9.0ml葡萄糖标准溶液于锥形瓶中。
3.2将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用标准葡萄糖溶液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，取其平均值（V1）。
3.3样品溶液预测和测定。
3.3.1 样品溶液的预测
精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，精密加入10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，控制在2分钟内加热至沸，保持溶液在微沸状态下以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品水解液液进行滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录葡萄糖标准溶液消耗体积。
3.3.2样品溶液的测定
精密吸取碱性酒石酸铜甲液与乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，精密加入蒸馏水10ml及玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品水解液，将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用样品水解液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，得出平均消耗体积（V2）。
最后计算结果乘以0.9，此为葡萄糖换算成粗多糖的细数。

我比较过这三种方法：滴定法和硫酸-苯酚法重复性都还可以，关键是试验操作人员要充分理解试验步骤，注意细节。滴定法主要就是离心、洗涤、滴定。硫酸-苯酚法如果也是采用醇沉得到多糖，操作步骤也是注意离心、和洗涤除去单糖；如果是用碱性二价铜试剂选择性地从高分子中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸法测定，需要注意的事项：在沉淀葡聚糖时尽量使被沉淀液里粗多糖的含量高些，然后在测定环节再稀释回适合浓度，这样可减少损失带来的误差，便于得到好的重复性；还有就是这一环节好多国标或文献给出的离心参数是3000转/分钟离心5分钟，试验过程中发现这个参数不合理，离心下来的沉淀在倾出上清液时会丢失，这也是好多试验人员说这个方法重复性不好的原因之一，参数应为4000转/分钟离心15分钟。蒽酮比色法不适合保健食品中多糖测定，应为这种方法需要测定液必须清澈透明，加热后不应该有沉淀；还有测定过程中所用蒽酮试剂中硫酸的浓度、取样液量、蒽酮试剂用量、沸水浴中反应时间，这几个操作条件的控制对试验结果影响很大，而且这几个条件之间是有联系的。不适合大生产检验。

这是本人在测定粗多糖过程中的一些体会，愿和大家一起讨论，以便得到一个科学，稳定的测定方法。

向日葵

1、我看过有些测定用的是6%的苯酚，这个浓度是依据什么定的？
2、用葡萄糖做曲线是有误差的，这个误差应该怎样消除？
3、迅速加入浓硫酸的话不会大量放热引起危险吗？立即摇匀也应该会放热，还需要水浴保温吗？
4、苯酚是一种剧毒，浓硫酸具强腐蚀性，试验中应该怎样防护？

279286232

虽然原花青素是多酚类的，但是检测多酚含量用原花青素的方法是不是未免不够确切啊～

jxjgz

众多文献中,苯酚都要蒸馏,请问是不是一定得经过蒸馏啊?

kidkitty

我的标准曲线的R 值为何总是那么低。苯酚硫酸法  做了几次了都失败

ettp1234

Thank you very much!

seagull_zj

回复 14# 向日葵
我就我的经验回答一下，希望大家补充
关于苯酚-硫酸比色法的提问
1、我看过有些测定用的是6%的苯酚，这个浓度是依据什么定的？
我们一般用的都是5%的苯酚，如果是重蒸过的苯酚最好，新开的一瓶问题也不大。
2、用葡萄糖做曲线是有误差的，这个误差应该怎样消除？
标准曲线有时候很难做，试管清洗干净非常重要，先用洗液浸泡之后可能会好很多。
3、迅速加入浓硫酸的话不会大量放热引起危险吗？立即摇匀也应该会放热，还需要水浴保温吗？
加冰浴比较好，显色平行一些
4、苯酚是一种剧毒，浓硫酸具强腐蚀性，试验中应该怎样防护？
没那么危险

shanyongkai

枸杞多糖的测定方法最为规范的应该是：按GB/T18672附录A的规定进行检测

清水绵长

《中国兽药典》2015/2020版二部 黄芪多糖注射液 含量就是用的苯酚-硫酸法，水浴加热显色（没说温度，默认沸水浴）。我的苯酚没有蒸馏，取苯酚晶体快速冲洗掉粉色物质，称取约10g，加水至50mL，离心沉淀不溶性油性物质，取上清液用于显色。结果重复性很差。网上和一些国标关于苯酚-硫酸法测定多糖的条件五花八门，有室温放置25分钟的，有30℃水浴的，有40℃水浴的，有90℃水浴的。显色后，有直接测定的，有加水定容后再测定的。而且样液、苯酚、硫酸的比例也各不相同。黄芪多糖注射液的标示含量为10ml:0.1g，不知道有没有其他准确又简便的方法。