功能性老年乳粉中300种非法添加药物的液相色谱-高分辨质谱分析

王中泰

         功能性老年乳粉中300种非法添加药物及其类似物的液相色谱-高分辨质谱分析

         前言

随着老龄化进程不断加剧,各类声称保健功能的老年乳粉不断涌现,一些生产企业通过非法添加化学药物来实现产品声称的显著功效,危害消费者健康。

         

现有标准方法需要按照功能声称分类别进行检测,不仅耗费人力物力,还严重制约了日常监管工作对未知风险物质的侦查能力。本工作应用QuEChERS净化结合具有Zeno SWATH®全息式数据非依赖型采集定量(DIA)技术的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱,建立了适用于功能性老年乳粉中300种非法添加化学药物的高通量筛查定量分析方法及未知结构类似物识别策略。

         

针对乳粉基质特点开发了QuEChERS净化流程,通过Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm, 2.6 μm)分离,以5 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和甲醇-乙腈(1∶1, v/v)作为流动相进行梯度洗脱。从线性范围、灵敏度、基质效应、精密度和准确度等方面对定量分析方法进行验证。在建立300种已知药物定性筛查数据库的基础上,应用电子激活解离(EAD)碎裂技术,获得丰富的二级质谱裂解碎片信息,通过归属分析对未知风险物质进行鉴别和确证。

         

所有已知目标药物在相应浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数>0.99, 检出限(LOD)和LOQ分别在0.04~2.7和0.2~8.0 μg/kg范围内。3个水平下的平均加标回收率为73.1%~125.2%,相对标准偏差(RSD)≤14.8%。将该方法应用于60份实际样品中非法添加物质的检测,在两份样品中分别检出苯乙双胍及西地那非药物,并成功识别出一种安非他明结构类似物乙非他明。该方法简便、灵敏、准确,对于功能性乳粉的日常监督执法工作具有实际应用价值。

         

1、 前处理方法
称取2 g乳粉样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL 40 ℃温水,涡旋1 min,使成均匀乳液。

加入10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液-乙腈(2∶8, v/v),随后加入2 g Na2SO4和0.5 g NaCl进行盐析,漩涡30 s,超声10 min, 4 ℃下以10000 r/min离心5 min。

移取4 mL上清液置于含500 mg EMR-Lipid的离心管中,涡旋振荡1 min,再离心5 min (10000 r/min, 4 ℃),取1 mL上清液加入l mL水,混匀后待测。

         

2 色谱条件
Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm, 2.6 μm);柱温40 ℃;流速为0.5 mL/min;进样量为10 μL。正离子模式MS检测时,流动相为(A) 5 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和(B)甲醇-乙腈(1∶1, v/v),梯度洗脱。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 5%B; 1.0~8.0 min, 5%B~45%B;8.0~17.0 min, 45%B~60%B; 17.0~20.0 min, 60%B~95%B; 20.0~22.0 min, 95%B;22.0~22.1 min, 95%B~5%B; 22.1~25.0 min, 5%B。

         

负离子模式MS检测时,流动相为(A)水和(B)甲醇-乙腈(1∶1, v/v),梯度洗脱。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 5%B; 1.0~8.0 min, 5%B~45%B;8.0~17.0 min, 45%B~60%B; 17.0~20.0 min, 60%B~95%B; 20.0~22.0 min, 95%B;22.0~22.1 min, 95%B~5%B; 22.1~25.0 min, 5%B。

         

3、 质谱条件
离子源:电喷雾离子源,正/负离子模式。离子源温度550 ℃,喷雾电压(IS) 5500 V,离子源气体1 (GS1)压力379.2 kPa(55 psi),离子源气体2 (GS2)压力379.2 kPa(55 psi),气帘气压力241.3 kPa (35 psi)。扫描模式:Zeno SWATH DIA。一级质谱参数:去簇电压(DP)50 V,质量数扫描范围20~1200,累积时间0.1 s。二级质谱参数:质量数扫描范围20~1200,根据m/z的实际分布,共拆分成12段可变窗口。使用SCIEX OS进行数据采集和处理。部分参数见原文表1。

         

4、数据库的建立及使用
将质量浓度为100 μg/L的单一分析物标准溶液注入UHPLC-QTOF-MS中,并进行数据采集,以低、中、高碰撞能量(20、35、50 eV)的DIA扫描模式,利用动态背景过滤(DBS)功能自动扣除背景离子,建立了包含精确质量数和片段离子的MS/MS谱库。筛查确认原则设置:精确质量数偏差绝对值≤5×10-6(5 ppm),保留时间误差≤0.2 min,差异同位素比≤10%,检索匹配分值≥90。

         

5、未知结构类似物的确证
取待测样品,采用优化后的色谱条件进行分离,确定保留时间后,按照优化后的质谱条件进行一级质谱扫描,得到准分子离子峰,经拟合确定化合物的分子式;对母离子进行子离子扫描,得到二级碎片质谱图,进而推断化合物母核及丢失碎片等基本结构。

         

结论
本研究建立了一种基于QuEChERS提取结合SWATH模式的UHPLC-QTOF-MS分析方法,用于老年乳粉中300种非法添加化学药物的快速测定。该方法通过优化的QuEChERS提取净化方法,实现了从复杂样品基质中同时提取具有不同理化性质及疗效的多类别药物。

         

优化后的方法在两种验证基质中的选择性、线性关系、灵敏度、基质效应、准确度和精密度结果令人满意,所有组分的分离检测在25 min内完成。在此基础上,采用EAD技术建立了一种未知物的非靶向筛查及鉴定策略。方法应用于不同地区市售真实样品的分析,在60份样品中检出苯乙双胍和西地那非2种非法添加药物,并鉴定出一种已撤出市场的减肥药品乙非他明,阳性样品检出率为5%。研究结果表明,新兴功能性乳粉可能对老年人存在潜在的健康风险,有必要进一步加大专项整治力度,扩大样品采集规模,全面开展涉老产品隐患排查。本研究建立的方法适用于多类别功能声称乳粉中300种化合物的高通量分析,同时为相关结构类似物的识别确证提供了一种有效的技术手段。

文章信息

色谱, 2023, 41(11): 960-975

DOI:10.3724/SP.J.1123.2023.05013