高效液相色谱 (HPLC) 硬件：色谱柱

王中泰

高效液相色谱 (HPLC) 硬件：色谱柱

两个熔块之间的固定相填料通过零死体积（ZDV）和配件固定位置。根据固定相颗粒大小的不同，熔块的孔隙率可为 2.5 或 10 µm。


标准高效液相色谱柱
分析行业使用的绝大多数色谱柱都是由不锈钢制成的。由玻璃和搪玻璃不锈钢制成的色谱柱有时也用于特殊用途。成本较低的不锈钢筒式色谱柱通常用于质量保证实验室。筒式色谱柱基本上是装有固定相填料的管子，没有端部配件。可重复使用的支架或终端配件用于将柱连接到 HPLC 仪器上。

市场上也有软聚合物外壳的色谱柱。径向压缩色谱柱，例如以 water associates 公司为标志的色谱柱，可通过对色谱柱内部施加水压来就地压缩固定相。这种色谱柱比不锈钢色谱柱便宜，既可用于分析，也可用于制备。

色谱柱类型
分析柱
液相色谱柱的长度从 10 cm ~ 30 cm不等。通常情况下，色谱柱是直的，必要时通过将两个或多个色谱柱连接在一起来增加长度。液相色谱柱的内径通常为 4 ~ 10 mm；填料最常见的粒径为 5 或 10 µm。目前最常用的色谱柱长度为 25 cm，内径为 4.6 mm，填料粒径为 5 µm。这种类型的色谱柱理论塔板数可达40,000 ~ 600,000/米。

保护柱
在分析柱之前引入一个保护柱，不仅可以去除溶剂中的颗粒物质和污染物，还可以去除与固定相不可逆结合的样品成分，从而延长分析柱的使用寿命。保护柱的作用是使流动相与固定相达到饱和，从而最大限度地减少分析柱中溶剂的损失。保护柱填料的成分与分析柱相似，但粒径通常较大。当保护柱受到污染时，需要重新安装或丢弃，然后换上新的保护柱。

色谱柱长度和内径
在分析应用中，使用的 HPLC 色谱柱长度为 5 cm、10 cm、12.5 cm、25 cm或 30 cm，内径（ID）为 3 ~ 5 mm。一般来说，5 ~ 15 cm的短分析柱通常装有小于 5 µm的小粒径填料。长色谱柱通常装有 10 µm的填料。很难有效地用非常小的填料（如 3 µm）来填充长柱。这种色谱柱的压力过大，可能无法正常使用。较小内径的色谱柱通常用于减少溶剂消耗。内径小于 1 mm和内径为 2 µm的微型和毛细管 HPLC 色谱柱也可在市场上买到，但这些色谱柱通常不用于常规质量控制的分析。

填料形状和孔隙率
用于 HPLC 柱填料的填料形状有两种：球形和不规则形。在分析应用中，球形填料是首选，因为这些填料更坚固，填料可提供可重复的色谱柱。使用不规则填料的色谱柱最初的效率不亚于球形填料，但过度使用后，不规则填料可能会破裂产生 "细粒"，从而导致压力大大增加。不规则大粒径的填料成本较低，因此通常用于制备和半制备应用。
用于分析小分子化合物的硅胶基填料通常具有 6 ~ 10 nm的孔径。填料的表面积可能在 200 ~ 600 m2/g 之间。20 nm及以上的大孔径填料比较脆弱，表面积较低。大孔径填料用于分析蛋白质和聚合物等大分子量化合物。

值得注意的是，不同供应商的商用色谱柱之间可能存在很大差异，而同一来源的所谓相同色谱柱之间也可能存在差异。色谱柱的理论塔板数、色谱峰不对称性、保留时间、选择性和寿命都可能不同。具有相同官能团（如十八烷基硅烷）的色谱柱之间的差异来自多个方面——即硅胶载体、硅烷选择（单官能团或多官能团）、键合化学相、孔径、粒径分布和填料表面积的不同。

衍生柱
衍生化涉及分析物与试剂之间的化学反应，以改变分析物的化学和物理特性。衍生化在 HPLC 中的四个主要用途是：提高可检测性、改变分析物的分子结构或极性以提高色谱效果、改变基质以提高分离效果，以及稳定敏感的分析物。
可以进行柱前或柱后衍生化。衍生化技术包括乙酰化、硅烷化和酸水解。
但缺点是：程序复杂，会造成分析误差，并增加总的分析时间。虽然衍生化有其缺点，但为了解决特定的分离或检测问题，可能仍然需要衍生化。

快速柱
这种色谱柱也具有相同的内径，但长度比大多数其他色谱柱要短得多，填充的填料直径为 3 μm。提高了灵敏度、缩短了分析时间、减少了流动相用量并提高了重现性。

分析柱
这是 HPLC 中最重要的部分，决定着分离的效率长度为 5 ~ 25 cm，内径为 3 ~ 5 mm。填料的粒径为 3 ~ 5 μm。液相色谱柱通过待测物与固定相之间以及待测物与流动相之间不同的分子间作用力实现分离。

制备柱
长度：10 ~ 15 cm，内径：4.6 mm，装有粒径为 5 µm的填料。这种色谱柱的理论塔板数可达10,000。
它由压力调节器和馏分收集器组成。压力调节器位于 HPLC 检测器的后方。

色谱柱温度控制器
为获得更好的色谱图且具有良好的重现性，应保持色谱柱温度恒定。有些色谱柱配有加热器，可将温度控制在接近环境温度的十分之几度。色谱柱还可配备从恒温水浴供应的水套，以实现精确的温度控制。在某些应用中，无需对色谱柱温度进行严密控制，即室温条件就可以了。