pH值/缓冲液对分离可重现性的影响

王中泰

pH值/缓冲液对分离可重现性的影响

相比于简单的非离子型化合物，可电离化合物会在分析时遇到一些新问题。众所周知，液相色谱中分析物的保留时间会随着电离水平的变化而急剧变化。因此，为了获得可重现的结果，分析物必须保持恒定的电离程度。这就要求电离程度在分析物 pKa 附近 ± 1.5 个 pH 单位范围内是稳定的。如果分析物只是碱或酸，则在 pH 值较高或较低时都能获得最佳结果。

几乎所有的碱都会在 pH 值为 2 的磷酸盐缓冲液中完全电离。另一方面，在 pH 值为 10 的碳酸氢铵缓冲液中，所有酸都完全电离，而大多数碱都不会电离。如果化合物电离程度在所考虑的 pH 值下都很明确，那么通常就没有必要非常精确地控制 pH 值。例如，使用三氟乙酸（pKa = 0.5）通常就足以在酸性 pH 值下实现均匀电离。

但是，如果分析物含有多个可电离基团，则通常不可能找到：一个在 pH 值发生微小变化时不发生电离的 pH 值范围。在中间 pH 值范围内的所有物质也是如此。在这种情况下，对 pH 值进行精确的控制是绝对必要的。因此，必须使用真正的缓冲液才能达到并控制所需的 pH 值。

如果做不到这一点，保留时间的重现性问题几乎不可避免，而且还会经常出现峰前沿或峰拖尾等峰形问题。除了使用真正的缓冲液之外，高精度地测量和控制 pH 也是获得可重现分离模式的关键。一方面，pH 值的变化是操作和优化可电离分析物分离的最佳工具。另一方面，必须对 pH 值进行精确控制。

缓冲强度和溶解性
为了实现良好的分离重现性，所用缓冲液必须有足够的缓冲能力。良好的缓冲液浓度约为 50 mM（毫摩尔）。但是，如果流动相中有机相的比例较高，这样的浓度可能会导致缓冲液出现沉淀。由于缓冲液和溶剂成分繁多，目前还没有表格说明反相色谱中所用缓冲液的溶解度。如果需要使用新的缓冲液/流动相组合，最好快速测试其在有机溶剂中的溶解度。这样做不仅不会造成困难，而且非常迅速，还能避免泵单向阀中盐类沉淀带来的麻烦。

相比于传统的 HPLC，在 LC/MS （液相色谱-质谱联用）中，目前使用的缓冲液浓度一般在 10 mM左右，因此对保留的控制能力会有所降低。当然，质谱仪的特异性也能够弥补色谱方面的某些不足。
恒定缓冲液浓度

如今，HPLC 仪器通常用于将水性缓冲溶液与流动相中的有机成分混合。对于等度分离来说，这只是一个方便的选择，但对于梯度分离来说，这却是一个无法绕过的问题。在正常情况下，这种方法意味着缓冲液的离子强度会随着流动相中水组比例的变化而变化。

不过，还有另一种方法可以解决这一问题，而且这种方法可以使缓冲液的浓度在梯度上保持不变。HPLC 仪器的梯度混合器需要三个溶剂入口来实现这一目的。其中一个入口连接水，第二个入口连接流动相中的有机溶剂，第三个入口连接缓冲液。然后在整个梯度过程中以流速 10% 的恒定速率加入缓冲液。缓冲液的浓度是流动相中所需最终浓度的十倍。关于有机溶剂，梯度混合与往常一样。梯度混合器通常有四个入口。如果一个用于加入甲醇，另一个用于加入乙腈，那么就已经具备了自动方法开发的部分基本装置。

总结
反相色谱中的大多数分离问题都需要缓冲流动相。本期介绍了缓冲液选择的可能性以及可能遇到的复杂情况。过去十年间，人们对缓冲液在有机溶剂存在下的特性有了更多的了解，但仍然可以期待未来对这方面知识的改进。