SDS-PAGE如何跑出漂亮的图片？

王中泰

SDS-PAGE如何跑出漂亮的图片？

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，主要用于根据蛋白质的分子量大小将其分离。SDS-PAGE通过使用十二烷基硫酸钠（SDS）和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）的组合，消除了蛋白质的电荷和结构差异，从而仅根据分子量的差异来分离蛋白质，广泛应用于生物医学研究、蛋白质纯化、疾病诊断等领域。通过SDS-PAGE，研究人员可以准确地分析蛋白质的分子量，检测蛋白质的纯度和浓度，以及鉴定蛋白质的种类和数量。

此外，SDS-PAGE还可以用于检测蛋白质的降解、修饰和相互作用等。

许多小伙伴们在跑SDS-PAGE时，经常会出现条带弯曲，拖尾，弥散等现象，以下是一些有助于跑出漂亮电泳图片的方法：

一、样品制备

蛋白质提取

选择合适的提取缓冲液：缓冲液的成分和 pH 值要根据目标蛋白的性质来确定。例如，对于大多数水溶性蛋白，可以使用含有 Tris - HCl（pH 7.5 - 8.0）、NaCl 和适当蛋白酶抑制剂的缓冲液。蛋白酶抑制剂能防止蛋白在提取过程中被降解。确保蛋白完全溶解：如果蛋白溶解性较差，可以适当增加一些助溶剂，如尿素或 SDS（十二烷基硫酸钠）。但要注意，SDS 的终浓度在用于电泳的样品中一般要控制在合适范围，通常为 1% - 2% 左右，过高可能会导致蛋白过度变性或出现其他异常。

样品处理

定量准确：使用可靠的蛋白质定量方法，如 Bradford 法或 BCA 法，确保每个样品的蛋白量一致。这对于获得清晰、可比较的条带至关重要。一般来说，上样蛋白量在 10 - 50μg 之间比较合适，具体要根据蛋白的特性和凝胶的浓度来调整。加入适量的上样缓冲液：上样缓冲液中含有溴酚蓝等指示剂，方便观察上样过程和电泳进程。同时，它还含有甘油，可以增加样品的密度，使样品能顺利沉入加样孔底部。上样缓冲液与样品的体积比一般为 1:1 - 1:4。煮沸样品：在加入上样缓冲液后，将样品在 100℃煮沸 5 - 10 分钟。这一步骤可以使蛋白充分变性，打开其高级结构，保证蛋白在电泳过程中能够根据分子量大小进行分离。

二、凝胶制备

选择合适的凝胶浓度

根据蛋白分子量范围选择：不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶对不同分子量范围的蛋白有较好的分离效果。例如，5% - 10% 的凝胶适合分离较大分子量（大于 100kDa）的蛋白，12% - 15% 的凝胶常用于分离分子量在 10 - 100kDa 之间的蛋白，而 18% - 20% 的凝胶则对小分子蛋白（小于 10kDa）分离效果较好。

确保凝胶均匀无气泡

小心灌胶：在灌胶过程中，要缓慢匀速地将凝胶溶液倒入玻璃板之间，避免产生气泡。如果有气泡，可以轻轻敲击玻璃板，使气泡排出。特别是在分离胶和浓缩胶的界面处，要确保平整无气泡，否则会影响蛋白的聚焦和分离效果。等待凝胶聚合充分：分离胶聚合时间一般需要 30 - 60 分钟，浓缩胶聚合时间约为 30 分钟左右。可以通过观察凝胶表面是否有反光、液体是否不再流动等现象来判断凝胶是否聚合完全。未完全聚合的凝胶会导致蛋白在电泳过程中出现弥散现象。

三、电泳过程

电泳缓冲液的使用

正确配制缓冲液：SDS - PAGE 电泳常用的缓冲液是 Tris - 甘氨酸缓冲液（pH 8.3）。缓冲液的浓度和成分要准确配制，以保证稳定的电场和合适的离子强度。一般来说，缓冲液可以预先配制好并储存于 4℃，使用前检查其 pH 值是否发生变化。
保持缓冲液新鲜：多次使用的缓冲液可能会因为离子浓度变化、杂质积累等因素而影响电泳效果。如果电泳过程中发现缓冲液颜色变深或者出现沉淀，最好更换新的缓冲液。

电压和时间设置

根据凝胶大小和蛋白分子量设置电压：对于较小的凝胶（如 8 - 10cm 长的凝胶），浓缩胶阶段可以使用 80 - 100V 的电压，使蛋白样品在浓缩胶中聚焦。当溴酚蓝指示剂进入分离胶后，可以将电压提高到 120 - 150V。对于较大的凝胶或者需要分离较大分子量蛋白的情况，电压可以适当降低，以防止产热过多和蛋白条带变形。控制电泳时间：电泳时间根据凝胶长度、电压和蛋白分子量等因素而变化。一般来说，当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部边缘时，电泳可以停止。如果电泳时间过长，小分子蛋白可能会跑出凝胶，导致丢失条带；而电泳时间过短，蛋白则可能没有充分分离。

四、染色和脱色

选择合适的染色方法

考马斯亮蓝染色：这是一种常用的染色方法，具有操作简单、成本较低的优点。将凝胶浸泡在考马斯亮蓝染色液（如 0.1% 考马斯亮蓝 R - 250、40%甲醇、10% 冰醋酸）中，染色 1 - 2 小时。这种染色方法可以检测到微克级别的蛋白。

银染：银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高很多，可以检测到纳克级别的蛋白。但是银染操作相对复杂，且容易出现背景染色过深等问题。银染过程包括固定、敏化、银染、显色和终止等多个步骤。

脱色彻底

考马斯亮蓝染色后的脱色：
考马斯亮蓝染色后的凝胶需要在脱色液（如 40% 甲醇、10% 冰醋酸）中脱色。脱色过程需要频繁更换脱色液，直到背景清晰、蛋白条带明显。一般需要更换 3 - 5 次脱色液，每次脱色 30 - 60 分钟左右，具体时间取决于染色的深度和凝胶的大小。

银染后的处理：
银染后的凝胶如果背景较深，可以使用适当的终止液和清洗步骤来改善。同时，要注意避免凝胶在处理过程中干燥，否则会产生难以去除的痕迹，影响图片质量。