一文读懂工业菌种分离、筛选与鉴定的全流程

王中泰

一文读懂工业菌种分离、筛选与鉴定的全流程

菌种分离筛选是从各类环境或样品中精准获取具有目标生产潜力的优良菌株，菌种鉴定是明确菌株的种类、遗传背景及安全性，二者共同为工业发酵提供优质、可靠的核心菌种基础。

       在发酵工业等诸多领域，获取性能优良的菌种是开展相关工作的关键前提。而菌种分离筛选与鉴定作为获得优质菌种的核心环节，有着一套科学且系统的流程，接下来就让我们一同走进这一重要的技术过程。

菌种分离筛选

      菌种的分离筛选主要包括随机分离筛选和定向筛选两种。其中，随机分离筛选是指先分离获得所有候选菌株，再结合工艺逐一筛选确定最佳菌种，工作量大且效果较差；定向筛选即在预先确定的筛选条件下分离纯化菌株，可以较快获得所需的目标菌种，获得的菌种可作为下一步选育所需的出发菌株，有时甚至可以将其直接作为工业发酵菌种。为了提高定向筛选效果，在确定定向筛选方案时，要充分考虑筛选的灵敏度和选择性。菌种的分离筛选工作主要应用于以下方面：

①从被污染的生产及科研用菌种中重新分离筛选所需菌株；

②发酵生产中长期使用菌种的定期分离筛选纯化；

③从各种菌种的发酵产品的产后微生物样品中分离筛选所需的菌株；

④从大自然中分离筛选新的菌株，包括寻找新选育方法处理后的微生物或传统发酵产品的新的优良菌株等。

       以从自然界分离筛选菌种为例，菌种的分离筛选主要有以下步骤。

1.样品的采集

       为了更有效地获得目标微生物，采集样品时，可遵循一定的规律，总的原则是：样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大，特别是在一些如高温、高压、高盐、低pH等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群，这种方法已经获得成功。一般的原则是：根据目标产物或功能来确定所要选择的菌株类型，再根据菌株类型选择其生长环境，同时，要了解目标产物的性质和可能产生目标产物的微生物种类及其生理特征，这样筛选微生物就能有的放矢，提高效率，事半功倍。

       微生物在代谢上具有一定的规律，可根据系统进化的观点来选择目的菌株，各类微生物虽然有许多差别，但是它们在生长、繁殖、代谢方面也存在一些共性，如初生代谢基本相同。若以生产次生代谢产物为目的，从细菌和真菌中往往都能分离筛选到目的菌株。相反，并不是所有微生物都能进行次生代谢，通常，只有丝状真菌、放线菌以及产芽孢的细菌能进行次生代谢，因此，如果要获得产生某些次生代谢产物的菌种，在系统进化上必须是产芽孢菌及其以后的更高级的进化种类才能筛选得到。

       分离不同种类的微生物时，还要考虑微生物生理特性，如pH、温度等，微生物代谢类型与其生长环境有很大相关性。

       一般从土壤中采集样品筛选菌种时要考虑土壤的以下特点：土壤的有机质含量和通风状况、土壤酸碱度和植被状况、地理条件以及季节因素等。若想进一步提高采集样品中的微生物的浓度，可以采取诱集的方法，在采样之前向预采样的环境中添加特殊物质，如石蜡等做成诱饵，以达到富集特定微生物的目的。

2. 样品预处理

       在分离筛选目标微生物之前，对包含微生物的样品进行预处理，可提高目标微生物分离的效率。通常使用的预处理方法包括物理方法和化学方法。

① 物理方法：主要有热处理、膜过滤和离心三种方法。热处理方法常用来增加耐热微生物的比例，膜过滤法和离心法常用来浓缩富集中的微生物细胞数量。

② 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物细胞数量。

3. 富集培养

       为了提高分离效率，可通过富集培养增加待分离目标微生物的数量，即根据不同种类的微生物生长繁殖过程对环境和营养要求的不同，使目的微生物在最适条件下迅速生长繁殖，增加数量，成为人工环境下的优势种。一般采用以下两类方法进行富集。

（1）控制培养基的营养成分

      在分离具有特定功能的某一类微生物之前，在培养基中加入只有该类微生物可利用的底物作为唯一的碳源或氮源，该类微生物能分解利用底物而得到充分的营养，进行迅速增殖，而其他微生物由于不能分解利用这些物质，生长则受到抑制。

（2）控制培养条件

       在培养过程中，常用的不同控制培养条件有：控制不同溶氧浓度，可将好氧和厌氧微生物分开；控制不同温度，可将嗜热和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸和嗜碱微生物分开；控制高糖或高盐浓度培养基，可获得耐高渗的微生物；控制高压培养条件，可获得耐高压的微生物。此外，在培养基中加不同的抗生素可以获得具有相应抗性的微生物菌株。

       富集培养按其培养方式可分为三类：分批培养、连续培养以及半连续培养。

       分批培养是在同一种培养基上重建选择压力，在目的培养菌株占优势的情况下移种，经过几次富集继代分批培养后，可取少量富集的目的菌株接种到固体培养基上进行纯分离。

     目的菌株在富集培养过程中能否占优势，取决于它与其他微生物的最大比生长速率（比生长速率是指单位菌体在单位时间内生长所增加的菌体量）的竞争。因此，可采用连续富集培养。

       连续培养是利用比生长速率进行富集。根据Monod方程：


        比生长速率（μ）与限制性基质浓度（S）有关，通过改变限制性基质浓度S，
可以控制各种不同菌体的比生长速率，从而可以富集分离得到所需的菌株。



基质浓度对A、B两个菌株的比生长速率的影响

       如图所示，对于A、B两种菌，当S<S₀（S₀为A、B两种具有相同比生长速率时的限制性基质的浓度）时，B菌株将维持比A菌株高的比生长速率，此时将富集B菌株；当S>S₀时，A菌株将维持比B菌株高的比生长速率，此时将富集A菌株。
       半连续培养即分批补料培养，它介于分批培养和连续培养之间，在没有条件实施连续培养时，半连续培养也是富集培养的较好方法。

4. 菌种分离筛选

      菌种常用的分离纯化方法有：平板划线分离法、稀释分离法、涂布分离法、毛细管分离法、小滴分离法等。

菌种常用的筛选方法有以下几种：

（1）随机分离筛选

       随机分离筛选是根据菌种的产物设计高产培养基培养，并建立快速、灵敏和专一的产物检测方法，通过逐一检测随机分离纯化的大量菌株各自发酵产物浓度来决定所要筛选的目的菌株。主要技术关键：产物合成条件的选择与控制；相应快速、灵敏、专一的产物检测方法的确定。随机筛选工作量大、风险很高。

（2）选择性分离筛选

       选择性分离筛选是通过采用选择性培养基或控制培养条件来实现，例如，控制培养基营养成分、酸碱度、添加特殊基质或抑制剂；控制特定的培养温度、通气条件等。该方法是通过增加特定的选择压力，实现定向筛选，其筛选效率显著高于随机分离筛选。

       当然，随着分子生物学发展，也可采用基于分子标记辅助筛选方法，从而显著提高随机筛选的效率。若将分子标记辅助筛选与选择性分离筛选进一步结合，则菌株筛选效率更高。当以上方法都不适用于筛选目的微生物时，需要随机分离微生物、并通过检测微生物产物确定，会使筛选工作量大大增加。目前，建立的高通量筛选方法对于加快筛选工作进度具有重要意义。

（3）高通量筛选

       高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机组合和梳理配对，具体包括：利用全自动培养基制备与分装系统实现培养基灭菌、倒平板、分装，自动整菌台平板稀释仪对菌液稀释、涂平板，通过自动高通量克隆挑选系统挑取单克隆，微型高通量反应器（最多可培养孔数，96孔/板×128板=12 288孔）培养单克隆进行验证。利用高通量筛选仪器，实现了快速、准确、微量，一个星期即可筛选成千上万个样品，可以快速筛选大量诱变后的微生物群体，尤其适用无模型，且数量大的微生物筛选。该高通量筛选技术的优点是筛选基本可自动化、清洁、自动挑取单克隆，可在短时间内进行大量筛选，从而大幅提高了工作效率，而且利用机器人、计算机数据处理分析等手段，操作平行、结果具有可比性，可以快速优选出所需目的菌种，但目前自动筛选仪器的一次性设备投资还是很大，维护保养费用也较为昂贵。由于高通量筛选的真正目的是大幅度提高筛选效率，因此，开发无需采用大型高通量筛选设备的高效筛选方法更为重要。

5. 复筛

       复筛是在初筛基础上，结合发酵工业菌种的具体要求，进一步鉴定初筛所获得的几株菌种的安全性、稳定性和适应性等，尤其是其发酵生产能力，从而确定可用于发酵工业的生产菌株，或将其作为后续菌种选育的出发菌株。同时，在复筛过程中，还可以对所确定的目的菌株的发酵条件和培养基进行初步优化。

菌种鉴定

       筛选获得目的菌株纯化培养物后的首要工作就是菌种鉴定。目前，微生物鉴定工作主要包括以下内容：形态学特征、生理生化特征、全细胞脂肪酸组成、血清学试验与噬菌体分型、分子生物学鉴定、核酸的碱基组成、分子杂交等，具体如下：

（1）形态学特征

       形态学特征主要包括细胞表面形态、细胞内部的显微及亚显微附属结构等，以及菌落形态、颜色、大小、染色反应等特征。


（2）生理生化特征

       生理生化特征包括营养类型、对碳源、氮源的利用能力、对生长因子的需求、需氧性、对温度和pH以及渗透压的适应性、对抗生素及抑菌剂的敏感性、代谢产物分析及其与宿主的关系等。目前，应用较广的鉴定方法包括：BIOLOG碳源自动分析鉴定、API数值鉴定系统（主要应用于细菌和酵母的鉴定）、全细胞脂肪酸分析鉴定系统、细菌磷酸类脂分析等。

（3）血清学试验与噬菌体分型

       在生物体进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验（血清学试验）进行微生物的分类和鉴定，通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或黏液层的抗原性进行比较分析。目前，主要使用的方法包括：凝集反应、沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。此外，也可用纯化的蛋白质（酶）进行分析，以比较不同细菌同源蛋白质之间的相似性。

（4）分子生物学鉴定

       利用分子生物学方法比较分析不同生物系统发育的关系，从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。目前，主要鉴定方法包括：核酸序列分析法，分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ITS1-5.8S-ITS2序列等；蛋白质氨基酸序列分析等。对于真菌鉴定，18S rDNA序列保守性强，存在着广泛的种间同源性，如18S rDNA序列比对低于97.5%，该结果并不能真实反应菌种信息，而ITS序列保守性具有种内相对一致，种间差异较明显的特性，因此，ITS序列分析比对更适合于真菌物种的分子鉴定以及属内种间或种内差异较明显的菌群的系统发育关系分析。

（5）核酸的碱基组成和分子杂交

       生物的遗传信息以碱基排列顺序（遗传密码）形式排列在DNA分子中，碱基排列顺序的异同可直接反映生物亲缘关系的远近，且每一种生物都有不同的碱基组成，亲缘关系近的生物，G+C含量相似。目前，该方法主要采用比较DNA的碱基组成（G+C含量）和分子杂交（与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析）。

       目前，常用的菌种鉴定方法及其过程如下：首先，在获得该菌种纯培养菌落特征的基础上，进一步通过显微镜、电镜等对该微生物菌体形态结构进行观察；其次，对微生物生理生化特征进行分析；再次，通过分子生物学鉴定方法对微生物基因、氨基酸序列进行同源性分析。以上过程可通俗地概括为三个“一”，即：一幅图（该微生物菌落图、显微图以及电镜图）；一张表（该微生物生理生化特征分析结果一览表）；一棵树（基于核酸序列或氨基酸序列同源性分析的系统发育分子进化树）。   

       该方法适用于大多数微生物菌种的鉴定。如需确定微生物的亚种，还可通过随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、重复序列PCR指纹分析（rep-PCR）等方法进行进一步鉴定。

       在工业发酵中，优质菌种是决定产品产量、质量的核心，而菌种分离是获取优质菌种的源头关键。通过定向筛选、富集培养等手段，既能从自然界极端环境或传统发酵产物中挖掘新的高潜力菌株，拓展菌种资源；也能对退化、污染的菌种纯化复壮，恢复其生产性能。高通量筛选等技术的应用，还能大幅提升筛选效率，为工业发酵筛选出适配性强、产物合成能力突出的菌种，从源头保障发酵生产的基础效益。

       菌种鉴定则是确保工业发酵菌种安全稳定的重要屏障。借助形态学观察、分子生物学检测等多维度方法，可精准确认菌株种类、遗传背景与代谢特征，排除产毒素等安全隐患，尤其保障食品、医药类发酵产品的安全性；同时能明确菌株遗传稳定性，避免因菌种误判或混杂导致发酵过程波动、产物质量不均，为后续工艺优化和规模化生产提供可靠的菌种依据，助力工业发酵高效稳定开展。

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王中泰

yujiansp 发表于 2025-10-15 19:31
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王中泰

与快乐握手 发表于 2025-10-17 08:17
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