代谢调节的诱变育种：工业发酵菌种的改良技术

王中泰

代谢调节的诱变育种：工业发酵菌种的改良技术

技术是从已有的技术中产生的，是通过组合已有的技术而来的。我们做的技术发明是需求和现象的链接。

        基于代谢调节的诱变育种，作为代谢控制育种的核心手段，在工业发酵菌种领域占据着举足轻重的地位。它借助选育特定突变型，达到改变微生物代谢通路，降低支路代谢终产物生成或切断支路代谢途径，并提高细胞膜透性，从而巧妙引导代谢流向目的产物积累，为工业发酵高效生产目标物质提供了关键技术支撑，是推动工业发酵菌种改良与发酵效率提升的重要利器。

      常用的微生物代谢控制育种措施有以下几种：组成型突变菌株的选育、分解阻遏突变株的选育、抗（耐）反馈作用突变株的选育。

（1）组成型突变株的选育

       组成型突变是指原来受调节基因和操纵基因调节的诱导酶或阻遏酶，由于调节基因或操纵基因发生变异，酶的合成变为组成型，即不再受生长条件限制，合成量恒定的一种现象。 主要包括调节基因的组成型突变和操纵基因的组成型突变两种类型。

       微生物在包含诱导酶或阻遏酶的情况下，阻遏物结构由特异的调节基因决定，阻遏物通过与操纵基因结合，就会使该操纵基因控制下的某结构基因簇（操纵子）的转录受到抑制，如果产生这种阻遏物的基因发生变异，它所表达的阻遏物将没有活性，不能和操纵基因结合，该现象称为调节基因的组成型突变；如果由于操纵基因发生变异，导致操纵基因不能与阻遏物相结合，这时操纵子的转录也就不再受抑制，操纵子所决定的蛋白质就会以组成型的方式被合成，该现象称为操纵基因的组成型突变。

       在微生物发酵工业中，若想要获得大量高效降解某种多糖或蛋白质等生物大分子的水解酶，通常可采用组成型突变株选育方法，因为这类水解酶一般为诱导型酶，组成型突变株可以大大提高这类水解酶的表达量。目前，组成型突变育种较为有效的方法就是对菌株进行诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏物，或使操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，两种方法都可达到以上目的。

       组成型突变株选育的主要原则是创造一种有利于组成型菌株而不利于诱导型菌株生长的培养条件，使组成型菌株具有生长优势。具体的定向筛选方法如下。

①限量诱导物恒培养法：

      控制低于诱导浓度的诱导物作为碳源进行恒化连续培养。诱导型菌株不能生长，而组成型突变株可以产生分解底物的酶而正常生长，并通过连续补加新鲜的培养基，使组成型突变株数量逐渐增多，达到可以分离的浓度。例如，对大肠杆菌半乳糖苷酶的诱导型菌株进行诱变处理，在低浓度乳糖的恒化器中连续培养，不用诱导物，可生产半乳糖苷酶的突变株也可以大量生长，分离即可获得组成型突变株。

②循环培养法：

       在一个不含诱导物的培养基上两种菌都可以正常生长，但组成型突变株已经合成特定的酶，因此，再将两种菌在一个含有诱导物为唯一碳源的培养基上进行培养时，组成型突变株适应快、调整期短，经短时间培养后，即可占较大比例，如此反复多次循环培养，组成型突变株所占比例逐渐提高，分离即可获得组成型突变株。

③低诱导能力底物培养法：

       利用诱导能力很低但能作为良好碳源的底物作为唯一碳源对诱导后的菌液进行培养，组成型突变株因能合成分解该底物的酶，可以正常生长，而需要诱导的野生型菌则不能生长，分离即可获得组成型突变株。

④鉴别培养基法：

       利用在鉴别培养基平板上，两种类型（调节基因或操纵基因）的突变株均可形成不同颜色菌落的特性，可以直接挑选出组成型突变株。例如，利用甘油培养基培养大肠杆菌时，诱导型菌株不能产酶，组成型突变株可产生半乳糖苷酶，菌落长出后喷洒邻硝基 - 半乳糖苷，组成型菌株的菌落由于能水解它而呈现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化，分离即可获得组成型突变株。

⑤诱导抑制制法：

      即有些化合物能阻止某些酶的诱导合成，利用诱导物作为唯一碳源或氮源，添加诱导抑制剂后，只有组成型突变株能合成酶利用底物进行生长。例如，利用乳糖为诱导剂培养大肠杆菌时，在培养基中添加诱导抑制剂α - 硝基苯基 -β岩藻糖苷，只有组成型突变株可利用底物乳糖进行正常生长，分离即可获得组成型突变株。

       组成型突变株的选育是一种经典的代谢工程育种策略。它通过诱变和巧妙的筛选方法，获得调控基因发生突变的菌株，使其能够不受调控地、持续地合成目标酶。这种方法的核心优势在于解决了诱导型酶表达需要外源诱导物的问题，从而在工业发酵中实现了高产、稳定和低成本的生产，是微生物酶制剂工业中一项至关重要的技术。

（2）抗分解代谢物阻遏突变株的选育

       在微生物代谢过程中，一些易分解利用的碳源或氮源及其降解代谢产物，阻遏那些与较难分解的碳源或氮源利用相关的酶的合成，该现象称为分解阻遏。如果能筛选获得抗分解阻遏的突变株，则更便于发酵控制，简化发酵工艺，提高发酵水平。

①分解代谢物阻遏。

       分解代谢物阻遏又称广义的葡萄糖效应，是指所有迅速代谢物质都能抑制较慢代谢物质所需酶的合成，涉及一种激活蛋白对转录作用的调控，即在分解代谢物阻遏中，只有当一种称为分解物激活蛋白（CAP）首先结合到启动子上后，RNA聚合酶才能与启动基因结合。cAMP由腺苷酸环化酶催化ATP而产生，无论在原核生物或高等生物中，cAMP都是多种调控系统的重要因素，葡萄糖能抑制cAMP形成并促进cAMP水解并分泌到胞外，葡萄糖进入细胞后，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合。因此，分解代谢物阻遏实际上是胞内cAMP缺少的结果。

       在微生物发酵工业上，一般通过使用缓慢利用的碳氮源，如多糖、黄豆饼粉等，或流加低浓度的易利用的碳氮源，如葡萄糖、氨水等方法来避开分解代谢物阻遏作用。例如，高浓度的葡萄糖对青霉素转酰酶、链霉素转肽酶和放线菌色素合成酶等抗生素产生的关键酶均具有分解阻遏作用。主要是由于葡萄糖分解产物的积累，阻遏了抗生素合成关键酶基因的表达，从而抑制了抗生素合成。因此，在实际生产中，通常采用流加葡萄糖或应用混合碳源的方式控制葡萄糖分解中间产物的积累来减少其对发酵的不利影响。

②抗碳源分解代谢物阻遏突变株的筛选。

       碳源分解代谢物阻遏是指微生物在混合碳源条件下优先利用速效碳源，且该碳源的代谢产物会抑制其他非速效碳源代谢相关酶的基因表达和活性，从而影响非速效碳源的利用。抗碳源分解代谢物阻遏突变株的筛选即通过选育抗葡萄糖结构类似物突变株的方法，筛选抗碳源分解代谢物阻遏突变型。葡萄糖结构类似物包括2 - 脱氧 -D - 葡萄糖和3 - 甲基 -D - 葡萄糖等。如利用紫外线、亚硝基胍等对里氏木霉进行诱变处理，采用低剂量、多次复合诱变处理方法，以2 - 脱氧 -D - 葡萄糖作为降解产物阻遏物进行高效筛选，选育得到一株抗碳源分解代谢阻遏的突变株，使纤维素酶活力提高了3倍。

③抗氮源分解代谢物阻遏突变株的筛选。

       氮源分解代谢物阻遏主要是指分解含氮底物的酶受快速利用氮源的阻遏，次级代谢的氮降解物阻遏主要指铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素等生物合成具有分解阻遏作用。通过选育抗氮类似物和氨基酸类似物抗性突变株的方法筛选抗氮源分解代谢物阻遏突变型。氨结构类似物主要是甲胺等。如螺旋霉素的生物合成受铵根离子的阻遏，通过诱变选育获得耐甲胺的突变株，就可以解除此阻遏作用，从而提高螺旋霉素的发酵效价。

（3）抗（耐）反馈作用突变株的选育

      在生物合成途径中，广泛存在着反馈作用，即末端产物阻遏或抑制合成途径（包括分支途径）中第一个酶的表达或活性，降低末端产物的浓度就能积累代谢途径中间体，克服反馈作用，可从以下两方面着手。

①降低末端产物浓度。

      降低末端产物浓度主要是通过筛选代谢障碍突变株即营养缺陷型来实现。营养缺陷型是由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生化反应发生遗传性障碍，使菌株丧失合成某种物质的能力，导致该菌株在培养基中不添加这种物质，就无法生长，其在微生物遗传学上具有特殊的地位，不仅广泛应用于阐明微生物代谢途径，而且在工业微生物代谢控制育种中也具有重要意义。

      营养缺陷型有三种主要利用形式：可以阻断代谢途径，积累中间代谢产物；可以通过阻断分支代谢途径，改变代谢流向，从而积累另一条代谢途径的代谢产物；可以改变代谢流向，解除代谢终产物对合成途径的反馈抑制。

      育种中可以利用营养缺陷型菌株这一特性来积累有用的中间代谢产物。利用营养缺陷型协助解除代谢反馈调控机制，已在氨基酸、核苷酸等初级代谢和抗生素次级代谢发酵中得到很有价值的应用。

       渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性障碍不完全的突变型，其特点是酶活力下降但没有完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。获得渗漏型的方法是把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢且菌落小的即可。利用渗漏缺陷型的优点是既能少量地合成代谢产物，又不造成反馈抑制的现象。

       改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。例如，谷氨酸生产菌的细胞膜磷脂含量高时，细胞的通透性较差；磷脂含量低时，通透性较好。

②抗反馈作用突变株的选育。

       抗反馈作用突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株，其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。有两种情况可以造成抗反馈调节突变，一种是由于结构基因突变而使变构酶不能和代谢终产物相结合，失去了反馈抑制作用，称为“反馈抑制突变型”；另一种是由于调节基因突变引起调节蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用，因此，称为“抗阻遏突变型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用，产生类似于组成型突变的现象。

       一般来说，抗阻遏突变可使细胞内的酶成倍地增长，而抗反馈抑制突变以酶内置无变化。从作用效果上讲，二者都会造成终产物大量积累，而且往往两种突变同时发生，难以区别，通常统称为“抗反馈调节突变型”。

       在实际应用中，抗反馈突变株通常可以用添加末端产物类似物的方法来筛选。抗反馈调节的结构类似物主要有：Lys/苯酯基赖氨酸、α - 氨基己酰胺、γ - 甲基赖氨酸；Thr/邻甲基 -L - 苏氨酸；Met/乙硫氨酸，末端产物类似和末端产物结构类似，因而能够引起反馈作用，但是它们不能参与生物合成，因此，在培养基中添加末端产物类似物，出发菌株由于代谢途径受阻不能合成所需的末端产物，从而导致细胞死亡；对类似物不敏感的突变株将不受反馈抑制或阻遏的影响，在有类似物存在情况下也能正常合成该末端产物。如添加赖氨酸D - 精氨酸，诱变选育获得的谷氨酸棒杆菌抗反馈突变株，可明显提高L - 精氨酸产量。工业应用过程中，也可通过诱变选育改变菌体代谢流向，筛选无泡沫突变株。

       代谢控制育种通过选育特定突变型，直接干预微生物的代谢调控网络，是工业发酵菌种改良的核心手段。其主要作用在于解除菌体自身的代谢抑制：通过选育组成型突变株，使目标酶（如水解酶）的合成不再依赖诱导物，实现持续高效表达；通过选育抗分解代谢物阻遏突变株，克服快速利用碳氮源（如葡萄糖）对次级代谢产物（如抗生素）合成的阻遏，简化培养基配方；通过选育抗反馈突变株或构建营养缺陷型，阻断反馈抑制通路，使氨基酸、核苷酸等初级代谢产物大量积累。

       该技术体系的优势在于精准、高效且无需引入外源基因。它显著提升了目标产物的产率，降低了发酵生产成本（如减少诱导物添加、利用廉价混合原料），并增强了生产稳定性。在酶制剂、氨基酸、抗生素及有机酸等多个生物制造领域，代谢控制育种仍是构建高产工业菌株不可替代的关键技术，为发酵工业的高效、低耗运行提供了核心支撑。