《冲柱指南》

王中泰

《冲柱指南》

做色谱实验，最闹心的莫过于用久了的柱子柱效下降、峰形拖尾、压力飙升。别着急，大多数时候不是柱子坏了，而是被污染了！不同类型的色谱柱，“污染来源” 不一样，冲洗再生的方法也得对症下药。

一、冲柱原则

溶剂必须互溶

比如水和二氯甲烷、正己烷和甲醇这类 “不互溶” 的溶剂，绝对不能直接切换，中间必须用乙醇、异丙醇这类 “桥梁溶剂” 过渡，不然两相分层，基线噪声大，还有可能超压。

冲洗前先除缓冲盐

缓冲盐遇纯有机相很容易析出结晶，堵死筛板和填料，所以第一步必须用纯水 / 高比例水相把盐冲干净，再换有机相。
冲洗时别接检测器

冲洗时可能会污染检测器，尤其色谱柱堵塞反冲时，单独接柱子冲洗更安全。

溶剂用量别省

常规每种溶剂至少用 20 倍柱体积冲洗，慢流速（比如 0.5-1mL/min）慢慢洗，给脏东西足够的时间 “溶出来”。

二、不同类型色谱柱，对应不同冲洗再生方案

1. 反相色谱柱：
反相柱是实验室的 “主力军”，污染类型也最多，不同脏污对应不同清洗方法。

基础再生流程： 95% 水 / 甲醇 → 甲醇 → 二氯甲烷 → 甲醇

先用水 / 甲醇冲掉缓冲盐和强极性杂质，再用甲醇置换，二氯甲烷可以洗掉强吸附的非极性杂质，最后过渡到甲醇保存。

针对性污染清洗方案：

🔹 盐析导致柱压升高：用 95% 水 / 乙腈小流速持续冲洗，可以用60℃水并加柱温，直到柱压稳定下降，再按基础流程再生。
🔹 非极性化合物强吸附：确保柱内无盐后，先用乙醇冲洗，再换二氯甲烷，能有效洗脱疏水杂质。

🔹 蛋白残留污染：

第一步：95% 水 / 乙腈过渡后，用 0.1% TFA 水梯度洗脱至 0.1% TFA（乙腈 / 异丙醇 = 1:2），破坏蛋白的疏水相互作用；
第二步：若柱子耐碱，可再用 95% 水 / 乙腈过渡后，用 5M 硫氰酸胍（pH7）清洗，彻底解离蛋白。

🔹 金属离子残留：用 0.05M EDTA 溶液冲洗，络合洗脱金属离子，再用纯水冲掉 EDTA，按基础流程再生。

🔹 离子对试剂污染：先 95% 水 / 乙腈过渡，再用 95% 乙腈 / 水长时间冲洗，但要注意 —— 离子对试剂污染后很难完全洗干净，日常尽量避免用强疏水的离子对试剂，或减少使用时间，建议专柱专用。

2. 正相色谱柱：
正相柱的污染多是强极性杂质残留，冲洗要从强极性溶剂往弱极性过渡，逐步把杂质 “带出来”。

推荐冲洗流程：乙醇 → 甲醇  → 二氯甲烷 → 正己烷，每一步都要保证溶剂互溶。

先用乙醇、甲醇等极性溶剂冲洗，再逐步过渡回弱极性溶剂，最后保存在正己烷里。

3. 阴阳离子交换色谱柱：
离子交换柱的污染的主要作用力是强吸附的离子作用和强吸附的大分子疏水作用。

推荐冲洗流程：纯水 → 缓冲盐浓度梯度（50mM-1M氯化钠，浓度梯度递增） → 纯水 → 甲醇 → 20% 甲醇

先用水过渡，再用氯化钠浓度梯度洗脱强结合的离子型杂质，再用水冲掉高盐，然后用甲醇冲洗疏水强保留的杂质，最后 20% 甲醇保存，防止微生物滋生。注：蛋白残留严重时，用5M 硫氰酸胍（pH7）清洗。

4. 尺寸排阻（SEC）色谱柱：
SEC 柱的填料比较娇贵，冲洗要温和，避免强溶剂破坏凝胶结构，蛋白残留和强吸附离子是主要污染源。

推荐冲洗流程：0.1M 磷酸盐（pH3） → 纯水 → 乙腈 → 纯水 → 5M 硫氰酸胍 → 纯水

先用盐溶液冲洗强吸附离子，纯水冲掉缓冲盐，再用高比例乙腈洗脱疏水杂质，蛋白残留严重时用 5M 硫氰酸胍（pH7）解离，最后用纯水保存，部分 SEC 柱不建议长期接触高比例有机相，需参考柱子说明书调整。

三、再生只是补救，日常维护才是关键

色谱柱的寿命，两分靠冲洗再生，八分靠日常维护保养：

流动相一定要过滤超声，加在线过滤器，避免颗粒杂质进色谱柱；

进样前处理好样品，尽量去除强吸附杂质、蛋白、脂质；
每次实验结束，按规定流程冲洗柱子，不要直接停在含缓冲盐的流动相里过夜；

强污染样品，优先考虑加保护柱，别让主分离柱 “直面伤害”。