胶原蛋白及其水解物的研究进展（1）

天然动物蛋白

1 引言

胶原蛋白常见于生物体内,在动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管内均有一定分布。目前许多实验都已经从猪皮和牛皮等动物皮中成功提取出胶原蛋白[1-4]。胶原蛋白的结构较稳定,人体不容易吸收。因此,胶原蛋白需要通过降解得到低分子活性肽从而提高吸收率[5]。1979年至今,胶原水解物的生理活性逐渐被人们发现,生理活性主要包括降低血压,抗衰老,抑制酪氨酸酶活性等。因此,胶原蛋白及其水解物的应用范围十分广泛,它们可以作为天然成分运用在在食品、美容、营养保健以及生物医学材料等诸多领域,拥有着广阔的应用前景。

2 胶原蛋白

2.1 胶原蛋白的组成与分布

胶原蛋白是细胞外基质(Extracellularmatrix, ECM)的主要组成成分,是动物体内含量最多,分布最广的蛋白质。胶原蛋白一词的起源可以追溯到希腊,最早出现于约1865年,在牛津词典中被定义为“构成动物结缔组织的、在蒸煮时能成胶的物质”。可见,最初人类对于胶原的认识基于动物结缔组织的宏观物理性质。被广泛应用于食品、生物医用材料等领域,是有关胶原的结构及性能表征的很多研究工作都是明胶领域的化学家完成的[6-8]。

1940年,Orekhovich 等用柠檬酸缓冲液(pH值为3.5~4.5)从大鼠皮中溶解出含有弹性蛋白和角蛋白的不溶于水的蛋白质,除此之外,还提取出来一种胶原的前驱体。这种从酸性盐溶液中提取的胶原被命名为“前胶原”。但是之后也有研究者发现并非只有酸性盐溶液中能够提取出胶原,中性盐和碱性盐溶液同样能做到。这种构建胶原蛋白质的单体是胶原的基本结构单位,胶原便是它多级聚集后得到的产物,1953年,它被Gross命名为“原胶原”。

在早期研究的时候,科学家们对于胶原存在着一个共识,即它只是一个结构单一的同时缺少生物活性和免疫原性的普通结构蛋白。然而,近30年来,随着生物科学的迅速发展,例如细胞生物学技术等技术得到了突破,人们对于细胞外基质,尤其是对作为细胞外基质的主要组成成分的胶原的兴趣愈发浓厚,从而丰富了对胶原蛋白的研究方法,提高了对胶原蛋白结构的认识。现在,学术界已经认定胶原蛋白并非是某个蛋白质的名称,而是一类在结构上既存在相同点,又存在差异的一类蛋白质。

2.2 胶原蛋白的概述

胶原蛋白被称为人体的“生命支架”[9],顾名思义,被誉为“生命支架”的胶原蛋白在细胞中起到支撑和保护的作用,这是由于胶原蛋白特殊的三螺旋结构赋予了它较好的力学性能与较高的机械强度。

胶原蛋白中含有19种氨基酸,包括甘氨酸以及羟脯氨酸等。甘氨酸(Gly)作为其中一种主要的氨基酸存在,由于它拥有着基本单位为(Gly-X-Y)的重复序列,所以甘氨酸在胶原蛋白中的理论含量约达33.33%;羟脯氨酸和羟赖氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸,与胶原蛋白的独特性能息息相关。

迄今为止,已发现的胶原蛋白有二十多种类型。在这些胶原蛋白中,I型、II型、III型、IV型胶原蛋白的研究较为普遍[10-13]。近十年发表的文献中,以上述几种胶原蛋白作为原料进行研究的比例达到95%以上,其他类型的胶原蛋白研究的类型较少,目前存在研究空白。

2.2.1 胶原蛋白的组织来源

I型胶原蛋白主要存在于动物的结缔组织,骨骼和皮肤,应用范围广泛。I型胶原蛋白是在研究食品和药品时的一种重要的蛋白,并且常被用作生物医用材料。II型胶原蛋白主要存在于透明软骨,椎间盘和玻璃体,有研究表明它可促进兔关节软骨细胞活化[14]及其再分化。III型胶原蛋白常见于子宫壁、血管壁以及皮肤处。IV型胶原蛋白则是在伤口愈合中可作为重要的基底膜而存在。

2.2.2 胶原蛋白的结构

胶原蛋白的三螺旋结构是由三条肽链相互缠绕构成的,而胶原蛋白之所以能表现出高机械强度,是因为构成三螺旋结构的肽链韧性很高,而且由于构成三螺旋结构的肽链内部的氨基酸之间存在内部作用,侧链中的极性基团由于范德华力、氢键、共轭效应等作用力达到稳定,而非极性基团是疏水基团,两种效应同时作用在胶原蛋白内部,使其获得了较好的拉伸性能。分子在经过束装排列后组成胶原蛋白,之后再进行共价交联,就形成稳定的胶原纤维。在胶原蛋白内部,构成其氨基酸序列的基本单位是Gly-X-Y形式的重复序列。甘氨酸是最小的氨基酸集团,它非常灵活,可以参与到各种构象的优化之中,能非常好的优化肽链的三螺旋构象。X、Y表示除甘氨酸外的任意氨基酸,X常为脯氨酸,Y常为羟脯氨酸[15]。

图1 胶原蛋白结构示意图

Fig.1 Schematic diagram of collagen structure

2.2.3 胶原蛋白的生物特性

在速冻食品中加入一定量的胶原蛋白,在改善产品口感的同时也补充了人体所必需的氨基酸[16];在某些食品的包装材料甚至是它们的标签中也都有胶原蛋白存在,这些胶原蛋白因其具有良好成膜性,和能够使产品保持颜色不变的抗氧化性而被应用于食品包装材料领域[17]。不仅如此,在对胶原蛋白进行适当的改性之后,被改性的胶原蛋白对人体而言生物相容性更好,而且它同时能够被机体降解,从而可以用于皮肤移植。因为有着较好的生物相容性,所以胶原蛋白可以在皮肤组织的内部对皮肤细胞的新陈代谢进行调节[18]。

3 胶原蛋白水解物

3.1 明胶的概述

根据A.G.Ward提出的定义,明胶是胶原在经过温和而不可逆的断裂后得到的一种胶原蛋白水解物[19]。不仅如此,从另一方面来看,动物的表皮或者结缔组织中的胶原可进行预处理转化,之后在适当的温度下提取出水溶性的一类物质,这类物质的总称也是明胶。明胶在一些物理和化学性质上表现优异。这些性质包括亲水性,凝冻能力强,可以可逆转化凝胶与溶胶、侧链基团活性高以及存在电荷随介质pH变化的典型两性特征[20]等。根据不同的处理方法,可以得到不同类型的明胶,这些明胶可以分为酸法明胶(A型明胶)、碱法明胶(B型明胶)和酶法明胶。明胶还可以根据用途被分成食用明胶、工业明胶和药用明胶等类型[21]。

3.2 胶原蛋白肽的概述

胶原蛋白肽为明胶在特定的温和条件下经水解制备得到的相对分子量较小的多肽混合物,经分离提纯后可得到具有多种生物活性的多肽[22]。胶原蛋白肽可以更好地被人体吸收。胶原蛋白肽的结构复杂程度不一,可以是简单的二肽、三肽,也存在着结构呈环形的大分子多肽。胶原蛋白肽在经过磷酸化、酰基化或者糖基化修饰之后,它们就可以在生命调节或者细胞代谢中发挥重要作用。现代生物代谢研究认为,人体摄入的蛋白质经消化系统消化后,更多的是以小肽的形式被人体吸收。胶原多肽因其对于人体而言容易被消化吸收而可直接食用,此外,它也可作为添加剂与其他原料复配在一起制备出营养产品[23-24]。

3.3 胶原蛋白、明胶以及胶原蛋白肽的区别

作为蛋白质的其中一种,胶原蛋白通常存在于动物组织器官中。在对胶原蛋白进行提取、分离时,根据提取与分离的方法和条件的区别,可以得到不同的产物,这些不同的产物分别是胶原蛋白、明胶和胶原蛋白肽。胶原蛋白与其他两种产物的区别在于,它在保留有生物活性的同时,三螺旋结构并没有改变。胶原蛋白经过一定的处理之后能够得到明胶,这些处理包括酸处理、碱处理或者高温处理使得胶原蛋白变性从而得到明胶。[25]胶原蛋白变成明胶的可能性很多,主要的可能性如下[26]:

(1)胶原蛋白的三螺旋结构完全松开,都变成盘曲的肽链的同时相互之间处于并未联结的状态,而且盘曲的三条肽链组成不同的同时,相对分子质量均处于80000~125000Da的不同状态;

(2)三螺旋结构中处于完全松开状态的肽链仅有一条,而其他的两条肽链则是共价键全部断开以氢键相连,相对分子质量为160000~250000Da;

(3)三条肽链在松开后全部处于联结的状态,以少量氢键联结在一起,相对分子质量为240000~375000Da。

明胶由胶原蛋白经变性而得到,发生的变化导致明胶的相对分子质量相比胶原蛋白低,分子质量的分布相对更宽,组成的氨基酸也出现了变化:一方面存在于胶原蛋白中的酰胺侧基逐渐被水解,酰胺侧基的水解会导致明胶中本来拥有的酰氨基含量降低,同时也代表着侧链自由羧基的数目增加。但并非所有的明胶都会出现这种现象,一般而言,酸法制明胶便无此现象;另一方面在胶原肽链中作为精氨酸残基的胍基会逐步地被转化成氨基,这就使得精氨酸残基转变成为了鸟氨酸残基。不过比起酰胺基的水解反应,这个反应的速度要较为缓慢一些[25]。

在明胶的定义上而言,它算是一种蛋白质,但它是一种热可溶性的混合物,而不是一种均一的蛋白质。明胶的相对分子质量分布较宽,而且明胶吸水性能比较强[27]。

从胶原蛋白肽的定义来看,胶原蛋白肽相对分子质量低于10000Da。在生产的过程中,来自胶原蛋白的三螺旋结构消失,三螺旋结构松开,诞生了3条互不联结的自由肽链,而且还降解成为了多分散的肽段[28]。

从结构上可以区分胶原蛋白、明胶和胶原蛋白肽胶原蛋白具有共价键连接三股α-肽链;明胶的共价键基本处于被打断的状态,只剩下了并非是共价键的次级键;但胶原蛋白本身基本上并没有被共价键和次级键束缚,而是比较自由的α-肽链或是明胶分子的片段。从性能上来区分,胶原蛋白拥有着成膜性,而且胶原蛋白形成的膜在柔韧性、强度和弹性方面表现良好。此外,将胶原蛋白溶液在模拟生理条件下放置25min,观察其吸光度的变化可推断出胶原蛋白分子之间可再次相互连接,从而形成纤维,这样就导致了吸光度上升的结果,而作为胶原蛋白的产物明胶和胶原蛋白肽则并没有具有这样的性质。在扫描电子显微镜的观察下则进一步地证明了氢键或者分子间的作用力使溶液中的胶原蛋白连接了起来,然后再通过交错排列的方式形成纤维,这种再纤维性基于三螺旋结构,明胶和胶原蛋白肽的三螺旋结构都是被破坏的情况,而且是不可逆的,即无法再次回到原先的三螺旋结构,因此明胶和胶原蛋白肽丧失了再纤维性。此外也存在其他可区分三者的理化性质[29]。