离子交换层析常见问题及解决方法

王中泰

离子交换层析常见问题及解决方法

离子交换层析是蛋白质分离纯化中常用的层析方法之一，因为其依据离子类型及离子强弱又进一步细分为多种介质，因此实际应用中需要依据自己的需求选择合适的产品。

离子交换层析常见问题及解决方法

1、如何根据工艺需求选择基质合适的离子填料？

● 在捕获阶段，为初步分离富集目的产物，可选择具有高吸附载量，适应高流速的大粒径基质；

● 在中间纯化阶段，为除去大部分杂蛋白，可选择具有高吸附载量和高分辨率的中等粒径基质；

● 在精细纯化阶段，为获得精纯的样品，可选择具有极高分辨的基质实验。

2、如何根据蛋白pI选择离子交换填料类型？

对于已知等电点蛋白：


如果蛋白在等电点之下最稳定，缓冲液pH≤目的蛋白pI，选择阳离子交换剂；


如果蛋白在等电点之上最稳定，缓冲液pH≥目的蛋白pI，选择阴离子交换剂。


● 缓冲液pH≥目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阴离子交换填料；

● 缓冲液pH≥目的蛋白pI 3个单位以上选择强阴离子交换填料；

● 缓冲液pH≤目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阳离子交换填料；

● 缓冲液pH≤目的蛋白pI 3个单位以上选择强阳离子交换填料。

对于未知等电点蛋白：
首先应选择阴离子交换剂，起始平衡液pH为8.0，然后再选择阳离子交换剂，起始平衡液pH为6.0。

3、加载样品时，流穿峰中有未结合目标蛋白

● 加载样品量过多，超出柱子的动态结合载量，可降低上样量；

● 柱料被污染，结合能力下降，应对层析柱清洗及再生；

● 缓冲液配制不合适，优化缓冲液pH和离子强度。

4、样品未按预期洗脱下来或产量较低

● 洗脱强度不够，增大洗脱液离子强度；

● 目标蛋白与填料结合过于紧密，应调整初始平衡液的pH；

● 目标蛋白在洗脱过程中发生聚集，应优化洗脱条件，保证蛋白稳定性；

●目标蛋白与填料发生非特异性吸附，可降低盐离子强度，减少疏水相互作用。

5、样品峰拖尾

● 错误的初始缓冲液，调整pH和缓冲液离子强度；

● 样品粘性过大，用初始缓冲液对样品进行稀释；

● 层析柱装填过于松散或上端被压缩，出现液面，重新装柱。

6、目标蛋白不能与其他杂质峰分开

● 初始缓冲液错误，调整pH和缓冲液离子强度，保证柱子完全平衡；

● 洗脱条件不佳，优化洗脱条件，降低流速，调整pH，使用更平缓的梯度；

● 层析柱分离效果差，检查柱效，确定是否需要重新装柱或更换预装柱；

●样品粘性过大，用初始缓冲液进行稀释，保证样品浓度在50mg/mL之下。