如何保证色谱柱的批内/批间重现性

王中泰

如何保证色谱柱的批内/批间重现性

问：
我即将开始开发一种新的 HPLC 方法。经过验证后，该方法将被转移到质量控制实验室，并在那里使用多年。我担心该方法的长期重现性，尤其是色谱柱的长期重现性。怎样才能确保良好的重现性？

答：
首先，请允许我赞扬您在开始研究之前就考虑到了方法的这一方面。如果可以预计一种新方法将使用数年，那么在选择色谱柱的过程中就应该考虑到这一点。您可能希望，色谱柱在该方法的预期使用寿命内都可以使用。这就意味着，您要选择一家经营规模较大、在可预见的未来仍有可能继续经营的制造商。此外，您还应选择“标准”表面化学组分（如 C18 或 C8），而不是新型和/或不常用的表面化学组分。换句话说，您的色谱柱选择应该是保守的。

下一个标准应该是色谱柱的重现性。如果您或您的同事在过去对某一色谱柱的重现性有良好的经验，这就是一个很好的起点。您还应该考虑制造商提供的信息。最近，一些色谱柱制造商开始公布其规格和批次间重现性研究的结果。您可以从生产商处获得这些信息，并对其进行严格检查。

问：
我要从这些信息中寻找什么？
让我回过头来解释一下批内/批间重现性的各个方面。

下面我将讨论反相填料，因为它们是最常用的填料。

如果使用同一批填料制成的不同色谱柱，则色谱柱的塔板数（峰宽）、压力和保留时间可能会有所不同。保留时间的变化与填料密度和色谱柱体积成正比，后者主要取决于色谱柱内径的重现性。由于所有色谱峰的保留时间都是按比例变化的，因此这种变化不会对您的方法造成损害，而且还能保持分离度。不过，您需要注意这一点，以便正确指定方法的洗脱时间窗口。

如果色谱柱制造商能很好地控制色谱柱硬件，这种效应导致的保留时间变化通常为 3% RSD（相对标准偏差），但也可能只有 1% RSD。
色谱柱塔板数的变化会影响你的方法，尤其是在处理几乎没有基线分离的色谱峰时。塔板数的典型重现性为 ±10%，但也有 RSD 仅为 2% 至 3%的情况。您应检查色谱柱制造商是否规定了塔板数的上限和下限。

对于任何给定的填料程序，色谱柱压力的可重现性都很高。特定包装批次内的差异应低于 ±5%（RSD）。

问：
批次间的重现性如何？
答：
如果您要查看不同批次填料的色谱参数的重现性，上述相同的参数也会发生变化。但更重要的是，分离的选择性会随着填料批次的不同而变化。这意味着色谱峰的相对保留会发生变化，即它们在色谱图中的相对位置会发生变化。这可能会影响方法的特异性。

这种变化是您需要防范的最重要问题。因此，您希望从色谱柱生产商处获得有关如何确保批次间重现性的信息。这通常需要对填料的物理、化学和色谱特性进行一些测量。在物理测量中，最重要的可能是填料的比表面积，因为该参数的变化会直接导致保留时间的变化。因此，您需要了解制造商可接受的比表面积变化范围。通常的范围是 ±10%，但也可以达到 ±5%。

作为最重要的化学参数，您希望了解键合相表面覆盖率的变化情况。通常用 μmol/m2 键合相来表示。许多制造商并不直接给出这一参数，而是给出了填料的碳含量规格。我们希望再次看到供应商能提供这些信息。优于 ±10% 的情况可能很常见，而小于 ±4% 的情况也是可以实现的。

最后，您需要了解填料制造商使用的色谱重现性测试。色谱柱通常会附有简单中性化合物（如甲苯、萘和蒽）混合物的色谱图。这不是一个很好的批次间重现性测试。中性疏水化合物之间的相对保留率具有极高的重现性，而且对填料表面覆盖率的变化非常不敏感。更好的批次间重现性测试是：在测试混合物中加入强碱性化合物。

在精心设计的测试中，精选的碱性化合物主要与填料上的“残存”硅醇基相互作用，而中性化合物则主要与键合相作用。因此，精选碱性化合物和中性化合物之间的相对保留是对反相填料批次间重现性的严格测试。如果生产商采用这种测试方法进行批间重现性测试，并制定了相当严格的规范，那么您就会更加放心。

问：
我不确定制造商的测试与我的实验中的化合物有何关联。怎样才能确保我的实验具有良好的批间重现性？
答：
您说得完全正确：上述信息只是一个起点，让您有机会选择一种具有良好重现性的色谱柱。但最终的结果还是对实验本身的重现性进行检查。一些制造商为此提供了由不同批次包装的色谱柱组成的套装。其他生产商则按需提供不同批次包装的色谱柱。请务必了解您将得到什么。不同批次的色谱柱含有相同批次的填料是没有用的，您需要用不同键合反应产生的填料填充色谱柱。如果生产商认为在不同日期用同一批次填料包装的色谱柱属于不同批次，则可能会引起混淆。因此，最好多问两遍，看看生产商是否真的提供了您想要的产品。

您可能希望获得三个不同批次的包装来测试方法的重现性。如果您的检测方法不受批次间差异的影响，那么您就可以放心，您的方法在未来几年内都将具有可重现性。