核酸浓度测定的5种方法，你都知道么？

王中泰

核酸浓度测定的5种方法，你都知道么？

核酸浓度的测定是分子生物学实验中的一项常规定量实验，对于确保实验的准确性和可重复性至关重要。

以下是几种常用的核酸浓度测定
方法：

1、紫外吸收法测定核酸浓度

原理：核酸分子中的碱基（嘌呤和嘧啶）在紫外光区，特别是在260nm处，具有强烈的吸收特性。通过测定核酸溶液在260nm处的吸光度（A260），并应用朗伯比尔定律（A=εcb），可以计算出核酸的浓度。该方法广泛应用于分子生物学实验中的核酸浓度测定，包括PCR产物分析、质粒提取效果评估、RNA提取质量检测等。


操作步骤：

①样品准备：将核酸样品溶解在适当的缓冲液中，确保浓度在可测定范围内。

②基线校正：使用分光光度计进行基线校正，以消除仪器误差。

③测定吸光度：在分光光度计中测定核酸样品在260nm处的吸光度。

④计算浓度：利用吸光度值和已知的摩尔吸光系数（ε），根据朗伯比尔定律计算核酸浓度。优点：操作简便快速，灵敏度高，是实验室中常用的核酸浓度测定方法之一。

缺点：只适用于浓度大于0.25ng/ul的样品，无法区分DNA和RNA，易受降解核酸、游离核苷酸及其他杂质的干扰。

2、荧光光度法测定核酸浓度

原理：荧光光度法基于荧光染料与核酸分子结合后产生的荧光信号进行测定。荧光染料（如SYBR Green、PicoGreen等）在特定波长的光源激发下能发出荧光，荧光强度与核酸分子的数量成正比，通过测定荧光强度，可以定量核酸的浓度。荧光光度法广泛应用于微量核酸的定量检测，如用于基因表达分析、病毒载量监测、基因组学研究等领域。



操作步骤：

①样品准备：与紫外吸收法相同，将核酸样品溶解于适当的缓冲液中。

②荧光染料结合：向核酸样品中加入荧光染料，混合均匀以促进染料与核酸分子结合。

③荧光测定：使用荧光分光光度计或荧光定量PCR仪等仪器测定样品的荧光强度。

④计算浓度：根据荧光强度值和标准曲线计算核酸的浓度。
优点：
灵敏度高，能检测到极低浓度的核酸，特异性好，可以区分DNA和RNA，不易受杂质的干扰。缺点：操作过程相对复杂，需要特定的试剂和仪器，荧光染料成本较高。

3、qPCR法测定核酸浓度
原理：qPCR法通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，实时监测荧光信号。

随着PCR反应的进行，荧光信号积累并达到阈值（Ct值），该Ct值与起始模板浓度的对数呈线性反比关系，利用Ct值和标准曲线，可以计算出待测样品的核酸浓度。该方法广泛应用于基因表达定量分析，病原体检测与鉴定，遗传病诊断，药物研发等领域。




操作步骤：

①样品准备：与紫外吸收法相同，但需特别注意避免污染。

②引物设计：根据目标序列设计特异性引物并进行合成。

③qPCR反应体系配制：包括模板DNA/RNA、引物、dNTPs、酶混合物、荧光染料或探针等。

④qPCR反应：将反应体系放入qPCR仪中进行扩增反应，并实时监测荧光信号变化。

⑤数据分析：

根据Ct值和标准曲线计算核酸浓度。
优点：
特异性强，灵敏度高，可定量范围广，能实现自动化操作和高通量检测。缺点：操作复杂，需要特定仪器和试剂，成本较高，易受实验条件的影响。

4、定磷法测定核酸浓度
原理：定磷法利用核酸分子中磷元素含量相对稳定的特性，在酸性环境中，核酸中的磷与定磷试剂（如钼酸铵）反应生成磷钼酸，进一步在还原剂作用下转化为蓝色的钼蓝化合物，钼蓝在650-660nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与核酸中磷含量成正比，间接反映核酸浓度。核糖核酸（RNA）含磷量约为9.5%，脱氧核糖核酸（DNA）含磷量约为9.2%，采用定磷法可准确测出磷含量，进而折算出样品中核酸含量。定磷法适用于对核酸含量进行粗略估计的场合，如科研中的初步筛选或教学实验中的演示等，测定范围在1-10μg。




操作步骤：

①样品处理：根据样品类型进行适当的前处理，如提取、纯化。

②酸解：将样品置于酸性环境中，使核酸完全水解为核苷酸和磷酸等小分子。

③显色反应：加入定磷试剂和还原剂，转化为钼蓝化合物。

④比色测定：使用分光光度计在特定波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算核酸浓度。优点：方法简单快速，灵敏度较高。缺点：易受蛋白质和核苷酸等杂质的干扰，影响结果准确性。

5、定糖法测定核酸浓度
原理：
定糖法基于核酸分子中的戊糖（核糖或脱氧核糖）在酸性条件下脱水生成醛类化合物，这些醛类化合物能与特定成色剂（如间苯二酚）反应，形成有色化合物，有色化合物的颜色深浅与核酸中戊糖含量成正比，间接反映核酸浓度。定糖法适用于对核酸含量进行初步估计的场合，准确性低于定磷法和紫外吸收法，其测定范围在20~250μg。

对于核糖的测定：生成的绿色化合物在入=670nm处有最大的吸收值。对于脱氧核糖的测定：DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-y-酮戊酸该化合物可与二苯胺生成蓝色化合物，在入=595nm处有最大吸收值。

操作步骤：

①样品处理：与定磷法相同，进行适当的样品前处理，如提取、纯化。

②酸解：在酸性环境中使核酸水解为戊糖等小分子。③显色反应：加入成色剂进行显色反应。

④比色测定：使用分光光度计测定吸光度，并根据标准曲线计算核酸浓度。

优点：
操作相对简单，对设备要求不高。缺点：特异性较差，易受其他糖类及其衍生物、醛类和蛋白质的干扰。