高效液相色谱法（HPLC）入门

王中泰

高效液相色谱法（HPLC）入门

色谱法是一种根据物质的分子结构和分子组成将混合物分离成不同组分的技术。这涉及到固定相（固体或附着在固体上的液体）和流动相（液体或气体）。流动相流经固定相，并携带混合物中的成分。与固定相相互作用较强的样品成分通过色谱柱的速度比相互作用较弱的成分慢。这种速度上的差异会导致各种成分的分离。色谱分离可使用多种固定相，包括玻璃板上的固定硅胶（薄层色谱法）、挥发性气体（气相色谱法）、纸（纸色谱法）和液体（液相色谱法）。

简介
高效液相色谱法（HPLC）基本上是柱式液相色谱法的一种高度改进形式。溶剂不是在重力作用下滴过色谱柱，而是在高达 400 个大气压 (psi) 的高压下强制流过。这样，速度就快多了。包括 HPLC 在内的所有色谱分离都遵循相同的基本原理：由于不同分子对流动相和分离所用固定相的相对亲和力不同，因此可将样品分离成不同的组分。

类型
根据工艺中的相系统（固定），HPLC 有以下几种类型：
正相 HPLC ：这种方法根据极性分离分析物。NP-HPLC 使用极性固定相和非极性流动相。因此，固定相通常为硅胶。典型的流动相有正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。因此，极性样品会被保留在色谱柱的极性表面上，比极性较弱的物质保留时间更长。
反相 HPLC ：固定相为非极性（疏水性），流动相为极性液体，如水和甲醇或乙腈的混合物。其工作原理是疏水相互作用，因此材料的非极性越强，保留时间就越长。

体积排阻 HPLC ：色谱柱中填充有精确控制孔径的材料，颗粒根据其分子尺寸被分离。较大的分子会迅速通过色谱柱；较小的分子则会渗入填料颗粒的多孔内部，随后洗脱出来。

离子交换 HPLC：固定相表面带有与样品离子电荷相反的离子电荷。这种技术几乎只用于离子或可离子化的样品。样品上的电荷越强，其被离子表面吸引的程度也就越强，因此洗脱时间也就越长。流动相是一种水性缓冲液，pH 值和离子强度都用于控制洗脱时间。
洗脱方式

在 HPLC 中，色谱的洗脱有以下两种方法：
等度洗脱：使用单一溶剂或成分恒定的混合溶剂进行分离。
梯度洗脱：采用两种或两种以上极性差异较大的溶剂系统。开始洗脱后，按程序改变溶剂的比例，有时是连续改变，有时是分步改变。梯度洗脱可大大提高分离效率。

硬件组成
HPLC 仪器包括输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据采集（处理）系统。系统的核心是进行分离的色谱柱。

溶剂储液器：
盛装流动相的玻璃储液器。HPLC 中的流动相或溶剂通常是极性和非极性液体成分的混合物，其各自的浓度根据样品的成分而变化。


输液泵：
泵将流动相从溶剂储液器中吸出，强制流经系统的色谱柱和检测器。根据色谱柱的尺寸、固定相的粒径、流速和流动相的组成等多种因素，可产生高达 42 Mpa（约 6000 psi）的工作压力。


进样器：
进样器可以是单次进样，也可以是自动进样系统。HPLC 的进样器应能在高压（高达 4000 psi）条件下对体积在 0.1~1.0 mL 范围内的液体样品进行进样，并具有较高的重现性。


色谱柱：
色谱柱通常由抛光不锈钢制成，长度在 50 至 300 mm之间，内径在 2 至 5 mm之间。色谱柱中通常装有粒径为 3-10 µm的固定相。内径小于 2 mm 的色谱柱通常称为微孔色谱柱。理想情况下，流动相和色谱柱的温度在分析过程中应保持恒定。


检测器：
HPLC 检测器位于色谱柱末端，在分析物从色谱柱洗脱出来时对其进行检测。常用的检测器有紫外光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器和电化学检测器。


数据采集(处理）系统：
检测器发出的信号可通过图表记录器或电子积分器采集，这些设备的复杂程度以及处理、存储和再处理色谱数据的能力各不相同。计算机将检测器对每种成分的响应进行整合，并将其放入色谱仪中，以便于读取和处理。


高效液相色谱仪系统图